苯并[a]芘活化小膠質(zhì)細胞致小鼠神經(jīng)毒性的作用研究.pdf

1、目的：
　　從體內(nèi)動物實驗、體外細胞培養(yǎng)兩方面探究活化小膠質(zhì)細胞引起中樞神經(jīng)炎癥反應在B[a]P致小鼠神經(jīng)毒性中的作用，為B[a]P神經(jīng)毒性機制的研究提供科學依據(jù)。
　　方法：
　　體內(nèi)實驗：將成年雄性SPF級ICR小鼠按體重隨機分為4組，分別設(shè)為溶劑（花生油）對照組，0.5 mg/kg、2.0 mg/kg和10.0 mg/kg B[a]P染毒組，每組10只，腹腔注射染毒，隔天染毒1次，共染毒30次。染毒結(jié)束后，用Mo

2、rris水迷宮、曠場試驗、懸尾實驗檢測小鼠的神經(jīng)行為功能和自發(fā)活動能力，用HE染色法觀察小鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞的形態(tài)學變化，并用免疫熒光技術(shù)和實時熒光定量PCR（RT QPCR）檢測皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞的活化（特異性蛋白Iba-1的表達）。
　　為了闡明小膠質(zhì)細胞活化與神經(jīng)細胞損傷之間的先后關(guān)系，又以同樣劑量組的B[a]P對小鼠分別染毒20次和10次，觀察小膠質(zhì)細胞活化以及神經(jīng)細胞的損傷，并用ELISA試劑盒檢測中樞神經(jīng)促炎癥細胞因子IL-1

3、β、TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-12的含量隨B[a]P染毒劑量和時間的變化。
　　體外實驗：以體外培養(yǎng)的小鼠N9小膠質(zhì)細胞株和小鼠海馬神經(jīng)元細胞株HT22為細胞模型，研究B[a]P活化小膠質(zhì)細胞在神經(jīng)細胞損傷中的作用。首先，以0.2μM B[a]P、2.0μM B[a]P和20μM B[a]P作用于HT22細胞，以DMSO溶劑處理作為對照組，觀察B[a]P的直接毒性效應。再將N9細胞株隨機分為6組，分別是空白對照組、D

4、MSO（溶劑）對照組，脂多糖（LPS）陽性對照組，0.2μM B[a]P、2.0μM B[a]P和20μM B[a]P染毒組，染毒6h、12h、24h和48h后，觀察小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學改變，用免疫熒光技術(shù)檢測小膠質(zhì)細胞活化的特異性標志物（Iba-1）的表達情況，用QPCR檢測Iba-1基因表達的改變。用活化N9細胞的上清液給HT22細胞全量換液12h、24h和48h后，觀察HT22細胞的形態(tài)學改變，CCK8法檢測細胞活力的改變。并用米諾

5、環(huán)素抑制N9細胞的活化后，用上述方法，觀察B[a]P對HT22細胞的毒性作用。綜合以上研究結(jié)果，分析活化小膠質(zhì)細胞在B[a]P致神經(jīng)細胞損傷中的可能作用。
　　結(jié)果：
　?。?）體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，B[a]P染毒30次后，隨著染毒劑量的增加，小鼠的空間學習記憶能力和自發(fā)行為活動逐漸降低，抑郁樣行為逐漸增多，顯著高于溶劑對照組（P＜0.05）。HE染色結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，低劑量組神經(jīng)細胞出現(xiàn)中度腫脹，有神經(jīng)纖維脫髓鞘現(xiàn)象

6、，中、高劑量組神經(jīng)細胞出現(xiàn)了變性、壞死，可見衛(wèi)星現(xiàn)象和噬神經(jīng)現(xiàn)象，亦有散在的細胞出現(xiàn)腫脹。免疫熒光和Iba-1基因表達量檢測結(jié)果顯示，隨著染毒劑量的增加，小膠質(zhì)細胞活化程度升高，Iba-1基因表達量逐漸增高（P＜0.05）。
　　同樣劑量組的B[a]P對小鼠染毒20次后，HE染色結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，低劑量組神經(jīng)細胞出現(xiàn)輕度腫脹，中劑量組神經(jīng)細胞腫脹明顯，且有神經(jīng)纖維的溶解，高劑量組有神經(jīng)細胞的變性、壞死，可見噬神經(jīng)現(xiàn)象，而

7、反映小膠質(zhì)細胞活化的標志物Iba-1在基因和蛋白表達水平均隨著染毒劑量的增加逐漸增多；染毒10次后，HE染色結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，低劑量組神經(jīng)細胞排列均勻、整齊，形態(tài)未見明顯異常，中劑量組神經(jīng)細胞出現(xiàn)輕度腫脹，高劑量組神經(jīng)細胞出現(xiàn)重度腫脹，中、高劑量組均未出現(xiàn)神經(jīng)細胞的變性、壞死。
　　對中樞神經(jīng)促炎癥細胞因子的檢測結(jié)果顯示，染毒10次后，各染毒組IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-12的含量呈劑量依賴性的升

8、高，均顯著高于溶劑對照組（P＜0.05）；這些促炎癥因子的含量在染毒20次、30次后，仍然維持在較高的水平，均顯著高于溶劑對照組（P＜0.05）。而且，隨著染毒次數(shù)的增加，各染毒組IL-1β的含量持續(xù)升高，與染毒10次相比，各染毒劑量組染毒20次和30次時的IL-1β的含量均顯著升高（P＜0.05）；TNF-α的含量在中、高劑量組染毒10次時已分別達到溶劑對照組的1.5倍和2倍，且隨著染毒次數(shù)的增加，其含量仍保持在較高的水平；各組MCP

9、-1和IL-6的含量在染毒20次時達到最高水平，染毒30次后有所下降，但仍高于染毒10次時的含量；而IL-12隨著染毒次數(shù)的增加，在各染毒組的含量變化不明顯（P＞0.05）。
　?。?）體外實驗結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量的B[a]P染毒的HT22神經(jīng)細胞，其形態(tài)學以及細胞活力均沒有明顯的變化，提示B[a]P對神經(jīng)元幾乎不具有直接的毒效應。0.2μM B[a]P、2.0μM B[a]P和20μM B[a]P作用于N9小膠質(zhì)細胞6h、12h

10、、24h和48h后，小膠質(zhì)細胞明顯活化，呈阿米巴樣形態(tài)，其活化的特異性標志蛋白Iba-1的表達隨染毒劑量和染毒時間均顯著地增加。ImageJ軟件分析結(jié)果顯示，染毒24h為小膠質(zhì)細胞活化最明顯的時間點。用B[a]P作用N9小膠質(zhì)細胞24h的上清液染毒HT22神經(jīng)細胞，隨染毒劑量的增加和染毒時間的延長，細胞存活率逐漸降低。米諾環(huán)素可以抑制小膠質(zhì)細胞的活化，用米諾環(huán)素與20μM B[a]P共同作用于N9小膠質(zhì)細胞的上清液染毒HT22細胞12h

11、后，細胞活力檢測，米諾環(huán)素與20μM B[a]P共同作用組的細胞存活率要明顯高于20μM B[a]P組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. B[a]P具有神經(jīng)毒性，能引起小鼠空間學習記憶能力降低，自發(fā)活動能力下降和抑郁樣行為增多。
　　2.中樞神經(jīng)炎癥反應以及神經(jīng)細胞的損傷可能是B[a]P神經(jīng)毒作用的主要機制。
　　3.活化小膠質(zhì)細胞引起的神經(jīng)炎癥反應介導了B[a]P的神經(jīng)毒性，抑制小膠質(zhì)細胞活化可延緩或減輕