小G蛋白RhoA在伊馬替尼耐藥中的作用及其調(diào)控的初步研究.pdf

1、研究背景和目的： 伊馬替尼(imatinib，又名STI571，商品名格列衛(wèi))是首個用于腫瘤臨床治療的分子靶向藥物，它因能特異性作用于一組蛋白酪氨酸激酶(包括ABL、Arg、Kit和PDGFR等)，而對多種腫瘤治療具有潛在的應(yīng)用價值。在臨床上，伊馬替尼主要用于慢性髓系白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)，其作用機制是競爭性地與P210BCR-ABL蛋白上的ATP結(jié)合位點結(jié)合，有效抑制P210BCR-AB

2、L蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，PTK)活性而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。2001年，伊馬替尼正式用于CML治療，取得了顯著的臨床療效，成為目前CML慢性期的首選治療。但值得注意的是，伊馬替尼治療對于CML急變期療效并不明顯，不少患者存在原發(fā)耐藥；而部分慢性期患者也在治療過程中出現(xiàn)繼發(fā)耐藥現(xiàn)象，其中多數(shù)很快進入急變期。因此，如何克服耐藥，延長患者的生存期也就成為了當(dāng)前CML治療中急待解決的突出問題。 有研究表

3、明，P210BCR-ABL蛋白可通過自身Db1同源區(qū)與RhoA等小分子G蛋白結(jié)合，并激活其下游通路，參與CML發(fā)病過程。而Ohmine研究發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼誘導(dǎo)耐藥的CML急變細胞系(命名為KCL22/SR)，其P210BCR-ABL蛋白表達及磷酸化程度并無增高，也不存在ab1激酶區(qū)點突變，進一步采用DNA表達譜芯片分析發(fā)現(xiàn)小分子G蛋白Rho家族重要成員RhoA高表達。我們前期研究中，應(yīng)用基因表達譜芯片技術(shù)對伊馬替尼誘導(dǎo)凋亡和誘導(dǎo)耐藥前后K

4、562細胞(CML急變細胞系)基因表達差異分析發(fā)現(xiàn)，RhoA在伊馬替尼誘導(dǎo)凋亡的K562細胞中(1.0uM伊馬替尼處理24小時)中呈低表達(ratio值0.321)，而在伊馬替尼耐藥的K562細胞中呈高表達(ratio值2.587)。這些研究結(jié)果提示RhoA可能在伊馬替尼耐藥中扮演了重要角色。 目前，RhoA在伊馬替尼耐藥中的具體作用仍不清楚。因此，本課題中，我們從臨床伊馬替尼耐藥CML患者和伊馬替尼耐藥細胞系兩個研究對象，檢測

5、耐藥前后RhoA表達變化，分析其調(diào)控機制；進一步應(yīng)用RNA干擾技術(shù)研究RhoA基因表達下調(diào)對耐藥細胞生物學(xué)行為的影響，為多靶點聯(lián)合治療伊馬替尼耐藥提供新的實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 研究方法： 1.臨床耐藥標(biāo)本的收集與耐藥細胞模型的建立 收集伊馬替尼耐藥前后CML患者骨髓白血病細胞，提取細胞總RNA和蛋白，-80℃保存?zhèn)溆?。前期研究中我們以野生型K562細胞(簡寫為K562-W)為對象，采用劑量遞增法，誘導(dǎo)出伊馬替尼耐

6、藥濃度為0.5uM，耐藥倍數(shù)為(2.04±0.16)倍的低度耐藥K562細胞。本實驗中，我們繼續(xù)用該法進行了耐藥細胞(簡寫為K562-R)的誘導(dǎo)，并用MTT法，流式細胞術(shù)和基因測序等技術(shù)對其進行生物學(xué)特性分析。 2.RhoA在伊馬替尼耐藥細胞中的表達分析 采用半定量PT-PCR和Westernblotting技術(shù)檢測伊馬替尼耐藥前后RhoA的mRNA和蛋白表達情況。 3.伊馬替尼耐藥中RhoA表達調(diào)控通路分析

7、 CML相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性抑制劑包括PD98059(Ras/MAPK信號通路特異性抑制劑)、LY294002(PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑)、AG490(JAK/STAT信號通路特異性抑制劑)分別處理K562-W和K562-R細胞2、4、8小時，采用Westernblotting技術(shù)觀察RhoA的蛋白表達變化。 4.特異性siRNA轉(zhuǎn)染K562-R細胞 按照siRNA設(shè)計原則，設(shè)計、合成4對siRNA-R

8、hoA(分別命名為siRNA-RhoA54，siRNA-RhoA153，siRNA-RhoA220，siRNA-RhoA256)，設(shè)陽性對照組(siRNA-GAPDH)和陰性對照組(siRNA-NC)。 流式細胞術(shù)分析不同終濃度(100nM、150nM和200nM)FAM熒光標(biāo)記siRNA-NC轉(zhuǎn)染K562-R細胞轉(zhuǎn)染效率；Western-Blotting檢測siRNA-GAPDH轉(zhuǎn)染24、48、72小時后對GAPDH表達抑制情

9、況，并檢測4對siRNA-RhoA轉(zhuǎn)染對K562-R細胞RhoA蛋白表達抑制情況。確定脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染K562-R細胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。 5.RhoA低表達對K562-R細胞生物學(xué)特性影響 PI染色后流式細胞術(shù)分析細胞周期變化；AnnexinV-PI雙標(biāo)法和Hoechst33258染色檢測細胞凋亡率；流式細胞術(shù)檢測CD71和GPA分析細胞紅系分化情況，并檢測CD29(整合素β1)分析細胞表面粘附分子表達差異。 研究結(jié)果

10、： 1.RhoA在伊馬替尼耐藥CML患者中的表達情況 共收集8名CML患者骨髓標(biāo)本，伊馬替尼治療有效5名(其中包括4名慢性期和1名急變期患者)，伊馬替尼耐藥患者3名(均為急變期患者)。RhoA的mRNA和蛋白在所有患者中均有表達；與非耐藥患者相比，伊馬替尼耐藥患者在mRNA和蛋白表達增多有顯著性意義(P值分別為0.031和0.014；SPSS10.0軟件，兩個獨立樣本的t檢驗)。 2.耐藥細胞誘導(dǎo)及其生物學(xué)特性分

11、析 伊馬替尼濃度遞增法誘導(dǎo)低度耐藥的K562細胞，經(jīng)3個月建立了耐藥濃度為1.0uM的K562-R細胞系。MTT法檢測K562-W和K562-R的半數(shù)抑制濃度(50％inhibitingconcentration，IC50)分別為(2.11±0.07)uM和(31.97±2.51)uM，K562-R耐藥倍數(shù)是(15.16±0.70)倍；兩組抑制率比較有顯著性意義(P<0.001；SPSS10.0軟件，配對樣本t檢驗)。基因測序未

12、發(fā)現(xiàn)K562-R細胞BCR-ABL基因激酶區(qū)點突變。流式細胞術(shù)分析K562-R細胞BCR-ABL激酶底物分子CRKL磷酸化程度增高(P<0.001；SPSS10.0軟件，四格表資料的x2檢驗)，間接提示耐藥細胞BCR-ABL激酶活性增強。信號傳導(dǎo)分子RhoA蛋白在耐藥細胞表達增多有顯著性意義(P=0.003；SPSS10.0軟件，兩個獨立樣本t檢驗)。 3.伊馬替尼耐藥中RhoA表達調(diào)控通路分析 PD98059(RAS-

13、MAPK通路抑制劑)對兩種細胞RhoA蛋白表達均有抑制作用，隨著處理時間的延長，K562-R細胞RhoA蛋白表達很快恢復(fù)，而K562-W沒有明顯恢復(fù)。LY294002(PI3K通路抑制劑)對K562-R和K562-W細胞RhoA蛋白均無明顯影響。AG490(JAK/STAT通路抑制劑)處理2小時，對兩種細胞RhoA蛋白表達都有明顯抑制作用，但均很快恢復(fù)。 4.siRNA-RhoA脂質(zhì)體法(lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染

14、K562-R細胞模型建立 FAM標(biāo)記的siRNA-NC脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染K562-R細胞，150nM濃度時轉(zhuǎn)染效率最高(75.28％)：siRNA-GAPDH轉(zhuǎn)染K562-R細胞48小時對GAPDH表達抑制最明顯；4對siRNA-RhoA轉(zhuǎn)染K562-R細胞，其中siRNA-RhoA-256對RhoA蛋白抑制率高于其它3對。故選取150nM濃度的siRNA-RhoA256轉(zhuǎn)染48小時的K562-R細胞做為下一步實驗的細胞模型。

15、 5.RhoA低表達對K562-R細胞生物學(xué)特性影響 siRNA-RhoA-256轉(zhuǎn)染48小時后，K562細胞出現(xiàn)凋亡，AnnexinV-PI雙標(biāo)FACS和Hoechst33258熒光染色分析細胞凋亡率分別為12.82％和9.0％，與陰性對照(分別為5.63％和3.5％)相比，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，G0/G1細胞增高(51.94％，P值小于0.001；SPSS10.0軟件，四格表資料的x2檢驗)。K562-R紅系

16、分化指標(biāo)CD71為49.89％，GPA表達率88.58％，與陰性對照相比變化不大，而細胞粘附分子CD29表達增多有顯著性意義(P值小于0.001；SPSS10.0軟件，四格表資料的x2檢驗)。 初步結(jié)論： RhoA與CML伊馬替尼耐藥的關(guān)系及其潛在功能與調(diào)控機制目前未見相關(guān)報道，我們研究發(fā)現(xiàn)： 1.RhoA在伊馬替尼耐藥與非耐藥CML患者中均表達，前者在mRNA和蛋白水平表達均高于后者，提示RhoA的高表達與伊馬

17、替尼耐藥密切相關(guān)，可能是臨床診治耐藥一個新的潛在靶點。 2.通過用多種CML相關(guān)信號通路抑制劑處理K562-R細胞，發(fā)現(xiàn)Ras-MAPK信號通路抑制劑PD98059和JAK/STAT通路抑制劑AG490對K562-R細胞RhoA蛋白表達均有明顯抑制作用，表明在P210BCR-ABL依賴的伊馬替尼耐藥細胞中，RhoA表達受多條CML相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)，可能是耐藥信號通路下游的一個關(guān)鍵點。 3.siRNA-RhoA256脂質(zhì)