小分子G蛋白RhoA在血管重塑中的功能研究.pdf

1、【研究背景和目的】血管重塑是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的共同病理生理基礎。小分子G蛋白RhoA的主要功能是調節(jié)肌動蛋白細胞骨架，其激活后可促進血管平滑肌細胞（VSMC）收縮、增殖和遷移，參與血管重塑。近年研究表明血管外膜也是血管重塑的重要參與者，以往用熒光差別顯示聚合酶鏈反應（Fluo-DD-PCR）技術發(fā)現(xiàn)RhoA在血管外膜成纖維細胞(AF)中表達，并初步研究了RhoA參與AF表型轉化的作用。本研究在此基礎上，進一步探討RhoA在血管外膜

2、重塑中的作用和機制，旨在發(fā)現(xiàn)血管外膜參與血管重塑的分子機制，為血管重塑相關疾病的臨床防治提供新策略。 【方法】應用pAdEasy-1腺病毒載體系統(tǒng)，細菌同源重組法構建重組腺病毒載體，成功構建了表達目的基因dominant-negative N19RhoA的重組腺病毒Ad-CMV-N19RhoA-eGFP，同時構建Ad-CMV-eGFP為對照病毒，感染體外培養(yǎng)的SD大鼠AF，免疫印跡觀察其對血管緊張素Ⅱ(AngII)刺激的AF/M

3、F細胞表型轉化標記分子a平滑肌肌動蛋白（a-SM-actin）表達的影響。通過BrdU摻入檢測Ad-CMV-N19RhoA-eGFP對AngII刺激的AF/MF細胞增殖的影響。同時用Rho pull-down方法體外檢測RhoA活性。建立SD大鼠頸動脈球囊損傷模型，通過重組腺病毒載體介導外膜局部基因轉導dominant negative N19RhoA，分別于術后7d、14d處死，細胞增殖核抗原PCNA、a-SM-actin免疫組織化學

4、、血管組織形態(tài)學觀察其對外膜細胞增殖、表型轉化、遷移以及血管損傷后新生內膜生成的影響。 【結果】 1.成功構建了重組腺病毒Ad-CMV-N19RhoA-eGFP和Ad-CMV-eGFP。 2.10-7mol/L AngII刺激體外培養(yǎng)的AF 細胞30min，其RhoA活性即較對照增強約3倍。 3.Ad-CMV-N19RhoA-eGFP (MOI=200)可明顯降低AngII (10-7mol/L)誘導的A

5、F/MF細胞表型轉化標記分子 a-SM-actin的表達。 4.Ad-CMV-N19RhoA-eGFP(MOI=200)明顯抑制AngⅡ(10-7mol/L)誘導的AF細胞 BrdU摻入。 5.免疫印跡結果顯示正常大鼠血管組織RhoA蛋白表達量較低，球囊損傷術后14d，大鼠損傷血管組織的RhoA蛋白表達量較正常對照組升高約4倍。 6.球囊損術后7d、14d，損傷血管大量新生內膜形成，血管腔明顯狹窄，同時血管組織大

6、量PCNA、a-SM-actin表達。 7.重組腺病毒Ad-CMV-N19RhoA-eGFP(5×108pfu/只)局部轉染血管外膜，免疫組織化學檢測血管組織eGFP表達，損傷血管外膜、中膜和新生內膜均有eGFP表達，而未損傷血管eGFP只在外膜表達。N19RhoA高表達使術后14d血管外膜、中膜和新生內膜eGFP陽性細胞較空病毒組減少了29.8±4.2％，并明顯抑制PCNA、a-SM-actin表達，顯著減少了術后新生內膜生成