小G蛋白Ran在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用與機制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是危害人類生命健康的惡性腫瘤之一。最新全球癌癥統(tǒng)計結(jié)果顯示，2012年度全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例140萬左右，死亡病例693900，其中發(fā)病率在男性中排名第三，女性中排名第二，死亡率在男性中排名第四，女性排名第三。在我國隨著人民生活水平的提高，誘發(fā)結(jié)直腸癌的高危因素也在同步廣泛流行，包括人口老齡化的發(fā)生、不健康的飲食方式、肥胖、吸煙等，因而近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升。而腫瘤的轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌致死的主要原因，也是影響患者預(yù)

2、后的重要因素。
　　為了探究結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制，我們課題組為此展開了系列研究。MC3是我們實驗室前期自主建立的一株結(jié)腸癌特異單抗，我們鑒定出其識別的抗原為Txl-2,后期發(fā)現(xiàn)Txl-2的剪接體Txl-2b與小G蛋白Ran相互作用，顯著促進(jìn)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。在此基礎(chǔ)上，我們對Ran做了功能學(xué)驗證和機制探索。結(jié)果顯示Ran在結(jié)直腸癌組織中、胃癌組織中、胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常組織，并且其高表達(dá)與腫瘤的分期及轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。在結(jié)直腸

3、癌細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞中，干擾Ran的表達(dá)可引起細(xì)胞體內(nèi)體外增殖能力減弱。在胰腺癌細(xì)胞，Ran表達(dá)的下調(diào)可引起細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯下降，研究還發(fā)現(xiàn)其調(diào)控機制與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及存活素Survivin表達(dá)下調(diào)，凋亡蛋白cleaved Caspase-3表達(dá)上調(diào)有關(guān)。而其促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移的機制則與雄激素受體Androgen Receptor、趨化因子CXCR4可能相關(guān)。研究至此，尚無直接證據(jù)證明Ran可以促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移，同時R

4、an在結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機制仍不清楚。
　　【目的】
　　1.檢測并分析Ran在結(jié)直腸癌中病理組織及細(xì)胞系中的表達(dá)與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　2.研究Ran對結(jié)直腸癌細(xì)胞系遷移侵襲能力的影響。
　　3.探索Ran促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制。
　　【方法】
　　1.小G蛋白Ran在組織與細(xì)胞中的表達(dá)檢測：
　　（1）免疫組織化學(xué)檢測 Ran在結(jié)直腸癌原發(fā)灶和配對陽性淋巴結(jié)中的表達(dá)，分析Ran的表

5、達(dá)強度與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　?。?）Western blot檢測Ran在永生化正常腸上皮細(xì)胞HIEC、結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、SW620、HCT116、Caco-2、HT-29、LoVo核蛋白中的表達(dá)情況。
　　（3）免疫熒光檢測Ran在結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480、SW620的亞細(xì)胞定位情況及熒光表達(dá)強弱情況。
　　2.構(gòu)建Ran的功能獲得、功能缺失細(xì)胞模型：
　?。?）將Ran特異性O(shè)ligo siRNA轉(zhuǎn)染

6、入結(jié)直腸癌細(xì)胞，在蛋白水平驗證通過 Western blot驗證siRNA的干擾效果。
　?。?）將最有效的的siRNA包裝構(gòu)建成慢病毒，穩(wěn)定下調(diào)Ran的表達(dá)，并通過Western blot和熒光檢測進(jìn)行驗證。
　?。?）構(gòu)建并轉(zhuǎn)染過表達(dá)Ran的慢病毒，并通過Western blot進(jìn)行過表達(dá)驗證。
　　3. Ran對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響：
　?。?）體外實驗通過Transwell遷移和侵襲實驗觀察Ra

7、n的功能獲得和功能缺失細(xì)胞模型遷移和侵襲能力的變化。
　?。?）體內(nèi)實驗通過裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移觀察Ran功能獲得和功能缺失細(xì)胞模型在體內(nèi)侵襲能力的變化。
　　4. Ran調(diào)控結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制研究
　?。?）利用Nanostring檢測技術(shù)探索Ran下游的分子表達(dá)變化及可能的信號通路。
　　（2）利用高通量表達(dá)譜芯片探索Ran下游的分子表達(dá)變化及可能的信號通路。
　?。?）通過RNAi技術(shù)、Western

8、blot檢測雄激素受體AR、LIN28B與Ran的表達(dá)失調(diào)的關(guān)系，通過Transwell遷移實驗驗證AR、LIN28B在結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力中的影響。
　　【結(jié)果】
　　1.在34例結(jié)直腸癌組織及其配對的陽性淋巴結(jié)標(biāo)本中，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示Ran在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶（陽性淋巴結(jié)）中的陽性表達(dá)率明顯高于結(jié)直腸癌原發(fā)灶中的表達(dá)，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.結(jié)直腸癌細(xì)胞系及永生化正常腸上皮細(xì)胞的核蛋白中Ran表達(dá)存在

9、差異，在人永生化正常腸上皮細(xì)胞HIEC表達(dá)極少，在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SW620、HCT116、Caco-2中Ran的表達(dá)明顯高于低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SW480、HT-29。
　　3.免疫熒光結(jié)果顯示，Ran主要定位于細(xì)胞核中，且高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系 SW620和SW480中Ran的表達(dá)存在差異。
　　4.合成的Ran特異的Oligo siRNA經(jīng)過轉(zhuǎn)染和驗證，si-1干擾效果最好，經(jīng)過慢病毒包裝后，在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HCT116中進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，經(jīng)

10、過嘌呤霉素篩選后，通過 Western blot和熒光顯影檢測，成功構(gòu)建了Ran的表達(dá)下調(diào)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系HCT116-siRan及對照HCT116-siNC。
　　5.通過對低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SW480進(jìn)行過表達(dá)慢病毒的轉(zhuǎn)染及續(xù)嘌呤霉素篩選，成功構(gòu)建了過表達(dá)Ran的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系SW480-Ran及對照SW480-NC。
　　6.體外實驗Transwell結(jié)果顯示細(xì)胞系HCT116-siRan的侵襲遷移能力較對照細(xì)胞系明顯減弱，細(xì)胞系S

11、W480-Ran的侵襲遷移能力較對照組明顯增強。該結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析有意義。
　　7.體內(nèi)裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移實驗顯示細(xì)胞系HCT116-siRan裸鼠肝臟中形成的轉(zhuǎn)移瘤較對照組明顯減少，細(xì)胞系SW480-Ran在肝臟中形成的轉(zhuǎn)移灶則明顯多于對照組，且HCT116-siRAN組裸鼠的生存期較對照組延長，體重動態(tài)變化在第18天出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。
　　8.細(xì)胞系Sw480-Ran中AR與LIN28B的表達(dá)均發(fā)生了上調(diào)，而在Caco-2細(xì)

12、胞中，干擾Ran的表達(dá)后AR、LIN28B的表達(dá)發(fā)生了下降。Ran、AR、LIN28B均主要表達(dá)在細(xì)胞核中，在Ran的表達(dá)下調(diào)后，AR、LIN28B的熒光表達(dá)也相應(yīng)的減弱。且干擾AR、LIN28B表達(dá)后可以減弱結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力。
　　9.通過送檢Nanostring以及高通量的表達(dá)譜芯片，對Ran的下游分子機制進(jìn)行探索，篩選出一批差異表達(dá)的基因，我們后續(xù)將利用這些大數(shù)據(jù)對Ran下游的信號通路及分子事件進(jìn)行生物信息學(xué)的分析，明