Ras相關核蛋白Ran促進結直腸癌惡性表型的機制研究.pdf

1、背景：
　　結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一。由于早期結直腸癌患者缺乏典型癥狀，多數患者就診時已發(fā)生遠處轉移。晚期結直腸癌患者治療效果不佳，五年生存率只有10％。因此對于中晚期結直腸癌患者，亟需一種或多種腫瘤標志物來判斷腫瘤的預后或預測腫瘤的治療療效以指導患者用藥，以期真正達到腫瘤的個體化治療。Ras相關核蛋白Ran是我們前期通過相關實驗發(fā)現，能夠和Txl-2b相互作用的蛋白質。Ran在正常細胞的物質核漿轉運和有絲分裂中發(fā)揮著重要作

2、用。近年來研究發(fā)現，Ran在大多數腫瘤中高表達，并且可以促進腫瘤的一些惡性表型的發(fā)生，例如促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤細胞的凋亡，誘導腫瘤細胞耐藥等，但是其促瘤機制目前尚不完全清楚。
　　目的：
　　1.檢測Ran在結直腸癌組織和細胞中的表達。
　　2.構建Ran的下調及過表達細胞模型。
　　3.觀察Ran對結直腸癌細胞增殖凋亡能力的影響。
　　4.觀察Ran對結直腸癌細胞侵襲轉移能力的影響。<

3、br>　　5.探討Ran促進結直腸癌惡性表型發(fā)生的分子機制。
　　方法：
　　1.檢測Ran在結直腸癌組織和細胞中的表達
　　1)IHC檢測Ran在結直腸癌組織芯片中原發(fā)灶、癌旁組織及轉移灶中的表達，分析Ran在正常組織、原位癌組織和轉移灶中表達強度的差異。
　　2)Western blot及實時定量熒光PCR檢測正常腸上皮細胞及多種結腸癌細胞株Ran的蛋白及RNA水平，并篩選出適合構建細胞模型的細胞株。

4、　　2.構建Ran的下調及過表達細胞模型
　　1)細胞瞬時轉染Ran-siRNA Oligos并驗證其干擾效率。
　　2)Ran-shRNA慢病毒感染HCT116及DLD-1細胞系構建Ran下調細胞模型并驗證其干擾效率。
　　3)Ran-sgRNA慢病毒感染HT29及SW480細胞系構建Ran過表達細胞模型并驗證其過表達效率。
　　3.Ran對結腸癌細胞增殖凋亡能力的影響
　　1)CCK8法在Ran的干擾和

5、過表達細胞模型中檢測腫瘤細胞增殖能力。
　　2)流式細胞技術檢測Ran-siRNA Oligos轉染后腫瘤細胞的凋亡。
　　3)Western blot檢測Ran-siRNA Oligos轉染后caspase-3和PARP的改變。
　　4.Ran對結腸癌細胞轉移能力的影響。
　　1)Transwell實驗在體外檢測 Ran的干擾和過表達細胞模型中結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力。
　　2)裸鼠尾靜脈注射腫瘤細胞

6、配合小動物活體成像技術檢測Ran下調細胞模型的體內轉移能力。
　　5.Ran促進結腸癌惡性表型發(fā)生的分子機制
　　1)Western blot檢測Ran干擾和過表達的細胞模型核漿蛋白中p53、β-catenin、NF-κB、EGFR以及總蛋白中EGFR、p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK的表達。
　　2)實時定量熒光PCR檢測Ran過表達細胞模型中EGFR的表達。
　　3)免疫熒光檢測Ran下調

7、后DLD-1細胞中Ran和p-EGFR的表達。
　　結果：
　　1.在45例結直腸癌原發(fā)灶組織、34例癌旁組織、51例轉移灶組織中，Ran在結直腸癌原發(fā)灶中的表達明顯高于癌旁組織（P=0.02），差異具有統(tǒng)計學意義。而Ran在結直腸癌轉移灶中的表達明顯高于原發(fā)灶（P=0.0008），差異具有統(tǒng)計學意義；實時定量熒光PCR和Western blot分別檢測Ran在結直腸癌細胞中mRNA和總蛋白水平的表達情況。結果顯示：無論是在

8、mRNA水平或總蛋白水平，Ran在結腸癌細胞中的表達明顯高于正常腸上皮細胞HIEC。
　　2.siRNA轉染HCT116和DLD-1細胞系，實驗組Ran蛋白水平表達量均明顯低于陰性對照組。HCT116細胞中，si-1和si-2在20nM時抑制效果最好，抑制效率均大于70%。DLD-1細胞中，雖然抑制效率不如HCT116，但同樣是si-1和si-2在20nM時抑制效果最好，抑制效率均大于50%。故選擇si-1干擾序列包裝慢病毒進行后

9、續(xù)實驗，且將體系中siRNA終濃度優(yōu)化為20nM；實時定量熒光PCR和Western blot結果顯示：在HCT116和DLD-1中，與對照組相比，實驗組Ran的mRNA水平分別下調了71%和59%。并且與對照組相比，Ran在蛋白水平也有較為明顯的下調。Ran的下調細胞模型構建成功。而在SW480和HT29中，與對照組相比，實驗組Ran在mRNA水平分別上調了3.5倍和3.7倍。并且與對照組相比，Ran在蛋白水平也有明顯的上調。故Ran

10、的過表達細胞模型構建成功。
　　3.在HCT116和DLD-1的Ran下調細胞模型中，與對照組相比，從第3天開始，HCT116實驗組細胞生長速度顯著降低；從第2天開始，DLD-1實驗組細胞生長速度顯著降低，結果具有統(tǒng)計學差異。在SW480和HT29的Ran過表達細胞模型中，與對照組相比，兩種細胞均從第5天開始，實驗組細胞生長速度顯著加快，結果具有統(tǒng)計學差異。
　　4.HCT116和DLD-1細胞si-1組早期凋亡率較NC組增

11、加，晚期凋亡率si-1組、si-2組晚期凋亡率較NC組顯著增加；si-1組和si-2組與NC組相比，caspase-3表達無顯著變化，cleaved caspase-3表達水平顯著升高。PARP表達有所下降，cleaved PARP表達顯著升高。
　　5.體外實驗結果表明，在Ran的下調細胞模型中，與對照組相比，HCT116和DLD-1細胞的遷移和侵襲能力均明顯減低。在Ran的過表達細胞模型中，與對照組相比，SW480和HT29細

12、胞的遷移和侵襲能力均明顯增強；體內實驗結果表明，穩(wěn)定下調Ran的HCT116細胞在裸鼠肺臟形成轉移灶的能力明顯低于對照組，鏡下觀察實驗組肺臟轉移灶的大小明顯大于對照組。
　　6.Western blot檢測核漿蛋白結果顯示：EGFR、β-catenin、NF-κB在細胞核中表達明顯減少；而p53在細胞核中表達明顯增多；在Ran的干擾細胞模型HCT116-shRan中，與對照組相比，p-EGFR、Akt、p-Akt、ERK、p-ER

13、K的表達均明顯減少。在Ran的過表達細胞模型SW480-Ran和HT29-Ran中，與對照組相比，EGFR、p-EGFR、p-Akt、ERK、p-ERK的表達均明顯增多。實時定量熒光PCR結果顯示：在Ran的過表達細胞模型中，與對照組相比，SW480-Ran的EGFR mRNA水平上調到原來的1.8倍，HT29-Ran的EGFR mRNA水平上調到原來的1.9倍。免疫熒光結果顯示：在DLD-1細胞中利用siRNA下調Ran的表達后，Ra

14、n的熒光強度下調72%，p-EGFR熒光強度下調35%。
　　結論：
　　1.Ran在結直腸癌癌旁組織、原發(fā)灶及轉移灶中的表達依次增高，且Ran在結直腸癌細胞系中高表達。
　　2.Ran可以促進結直腸癌細胞增殖，并且抑制caspase-3介導的凋亡作用。
　　3.Ran可以促進結直腸癌細胞發(fā)生轉移。
　　4.Ran可能通過調控EGFR的表達并影響Ras/MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路促進腫瘤的惡