重組人血白蛋白與小分子藥物結(jié)合功能研究.pdf

1、目的：人血白蛋白(簡稱HSA)是由585個氨基酸組成的非糖化單鏈結(jié)構(gòu)的心型分子，分子量約66500d，主要由人體肝臟產(chǎn)生，在血漿中含量為42±3.5g/L。人血白蛋白在臨床上主要用于治療嚴(yán)重的低蛋白血癥和失血性休克，在體內(nèi)可作為小分子藥物的載體能與藥物可逆性結(jié)合，從而影響藥物的代謝、毒性、儲存和運輸。目前臨床上所使用的HSA是通過低溫乙醇法或?qū)游龇◤娜遂o脈血漿或胎盤血中提取的血漿蛋白制劑，該方法一方面因血液受到潛在HIV病毒、肝炎病毒污

2、染而存在潛在的威脅，另一方面如果血源供應(yīng)不足，HSA也會發(fā)生周期性的貨源短缺。因此，研究開發(fā)更加安全并能保證供給的重組人血白蛋白(簡稱rHSA)引起眾多公司的興趣。據(jù)目前國內(nèi)外對人血白蛋白與藥物結(jié)合功能的研究，人血白蛋白有兩個主要的藥物結(jié)合位點，選擇華法令(結(jié)合位點Ⅰ)和地西泮(結(jié)合位點Ⅱ)作為人血白蛋白兩個主要結(jié)合位點標(biāo)志性結(jié)合藥物對重組人血白蛋白和天然人血白蛋白(簡稱pHSA)與小分子藥物的結(jié)合功能進行了比較，研究天然人血白蛋白和重

3、組人血白蛋白在與小分子藥物結(jié)合功能方面有無差別，并且用中藥有效成分鹽酸小檗堿再加以驗證。 方法：地西泮在366nm下有特征吸收，且易溶于甲醇等有機溶劑，難溶于水：而人血白蛋白在366nm下無吸收，但不溶于有機溶劑。經(jīng)過反復(fù)調(diào)整有機溶劑與水的混合比例，發(fā)現(xiàn)在10％甲醇溶液中地西泮和人血白蛋白都能很好地溶解，并且沒有沉淀生成。當(dāng)?shù)匚縻c人血白蛋白結(jié)合后形成人血白蛋白-地西泮復(fù)合物后，在366nm下地西泮的特征吸收消失?；谶@個原理，

4、取地西泮用10％甲醇溶解后，在366nm下測定不同濃度地西泮的光吸收，可以得到地西泮濃度-吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線。加入定量合適濃度的人血自蛋白，可以在366nm下通過測定特定濃度下的地西泮與人血白蛋白結(jié)合前后吸收值的變化計算得到二者的結(jié)合常數(shù)；在人血白蛋白體外功能研究中，華法令作為藥物結(jié)合位點I的特征藥物，可以結(jié)合在人血自蛋白的疏水位點上。人血白蛋白分子量為66500d，華法令分子量為338.34d，游離華法令與人血白蛋白-華法令復(fù)合物和游離人血

5、白蛋白分子量相差非常大?；谶@個原理可以通過Sephadex G-25凝膠過濾層析對游離華法令與人血白蛋白-華法令復(fù)合物和游離人血白蛋白實現(xiàn)很好的分離。Sephadex G-25 HPLC緩沖液為：67mmol/l PH7.4的磷酸緩沖液A；以緩沖液A配制86.3umol/l的華法令溶液B；以緩沖液A和脫脂后的pHSA和rHSA配制成31.5mg/ml溶液C；在308nm下對華法令和華法令與人血白蛋白混合的樣品分別進行Sephadex

6、G-25HPLC檢測，混合比例為250ulA+1500ulB+750ulC，并對HPLC出峰結(jié)果分別積分。因此在華法令與人血白蛋白結(jié)合后用SephadexG-25 HPLC柱進行分離后，對游離華法令和二者結(jié)合產(chǎn)物分別積分得到華法令與人血白蛋白的結(jié)合率。 人血白蛋白中的214乙酰色氨酸具有熒光性質(zhì)，根據(jù)熒光靜態(tài)淬滅理論，用鹽酸小檗堿(簡稱BH)為熒光猝滅劑，根據(jù)熒光測定值變化，可以計算藥物結(jié)合常數(shù)。取HSA溶液作為熒光激發(fā)光譜和發(fā)

7、射光譜掃描，當(dāng)激發(fā)波長為299nm時，發(fā)射光譜波長在353nm時熒光強度最大，并且BH在此條件下無熒光峰干擾。HSA濃度為4*10-5mol/L，在保證HSA終濃度不變的情況下，加入不同濃度的BH，在激發(fā)波長299nm和發(fā)射波長353nm條件下測定對HSA的熒光猝滅情況，從而得出人血白蛋白和鹽酸小檗堿的解離常數(shù)。 結(jié)果：重組人血白蛋白與地西泮的結(jié)合常數(shù)為14.68molDiazepam/mol rHSA，而天然人血白蛋白與地西泮

8、結(jié)合常數(shù)為12.82mol Diazepam/mol pHSA；重組人血白蛋白中華法令的結(jié)合率為8.69％，而天然人血白蛋白中華法令的結(jié)合率為6.73％；重組人血白蛋白與鹽酸小檗堿的結(jié)合常數(shù)為2.44×103l/mol，而天然人血白蛋白與鹽酸小檗堿的結(jié)合常數(shù)為2.77×103l/mol。 結(jié)論：重組人血白蛋白與天然人血白蛋白在與地西泮和華法令的結(jié)合功能上基本一致，鹽酸小檗堿的研究進一步證明了這一點。因此可以認為重組人血白蛋白和天