蛋白大分子藥物緩釋劑型的研究及在重組人生長素中的應用.pdf

1、重組蛋白藥物代表了一類具有天然結構和高度生理活性的新型藥物。自1982年問世以來得到了迅猛的發(fā)展,短短20多年時間里已有約165個產(chǎn)品應用于臨床,還有約270個正在研發(fā),年銷售額已達400億歐元,并且造就了Amgen、Genentech、Biogen、Genzyme公司等這樣的大型跨國醫(yī)藥企業(yè)。隨著重組蛋白藥物品種的增加及其應用的日益廣泛,由于蛋白大分子口服吸收率低、體內(nèi)半衰期短而采取的注射給藥的方式已經(jīng)越來越不能滿足治療的需要。比如,

2、對于需要長期治療的疾病,長達幾年甚至一生的頻繁注射,極大地影響了患者用藥的順應性；而對于只有一次注射機會的器官修復治療,外源性重組細胞生長因子蛋白僅僅幾個小時甚至幾十分鐘的體內(nèi)半衰期遠遠不能維持長達幾周的組織修復過程。通過輸入基因在病變組織表達細胞因子的辦法同樣面臨著基因的非病毒輸送以及對于表達過程的調(diào)控等一系列難題。作為延長這類藥物的體內(nèi)作用時間的辦法,緩釋技術因其不改變蛋白分子的自然序列和化學結構,在藥效、適應證和用藥安全性上相對于

3、其它長效方案具有明顯的有時甚至是決定性的優(yōu)勢。然而,蛋白大分子的緩釋面臨著一些棘手的技術挑戰(zhàn),以致本領域科學家31年的研發(fā)努力至今未曾導致一個成功的上市產(chǎn)品。由于蛋白大分子具有多肽所不具備的脆弱易變的高級結構,在小分子化學藥物和多肽藥物上成功應用的緩釋技術,因造成蛋白變性失活而不再適用。如何在緩釋劑型的制備過程中保持蛋白大分子的自然形態(tài)和生物活性是實現(xiàn)蛋白大分子緩釋的關鍵,也是本研究的目標。實現(xiàn)蛋白大分子緩釋的一系列技術挑戰(zhàn)包括：(1)

4、蛋白在制劑過程和有機溶劑或者水-油界面張力接觸而變性失活；(2)蛋白保護劑產(chǎn)生滲透壓而引起釋放初期的突釋；(3)緩釋期間蛋白發(fā)生聚集或在高分子上吸附而導致的不完全釋放；(4)為保護蛋白而不得不采取的復雜和再現(xiàn)性很差的制備工藝；(5)制備蛋白緩釋劑型的所有輔料必須能夠安全地注射于人體。蛋白大分子緩釋技術的成功有賴于對這些問題采取全面系統(tǒng)而不是顧此失彼的解決方案。對此,本研究采取了如下對策：(1)在溫和條件下將結構脆弱的蛋白制備成對苛刻條件

5、具有耐受性的多糖玻璃體微粒。本研究通過葡聚糖和聚乙二醇(PEG)水溶液的低溫誘導相分離或低溫水相-水相乳化,再通過進一步的凍干處理將結構脆弱的蛋白包封于葡聚糖微粒(直徑在0.5μm -5μm間可調(diào)的)中,從而避免了通常的水-油乳化和噴霧干燥方法中的水-油界面和水-氣界面對蛋白自然構象的破壞,同時使蛋白具有對有機溶劑和其他苛刻條件的高度耐受性。本研究還對文獻中用鋅離子沉淀蛋白的方法進行了改良,通過在PEG中的相分離使之從不規(guī)則的大顆粒變?yōu)?/p>

6、粒徑為0.2μm -0.5μm的細小的球形顆粒,從而提高了后續(xù)劑型制備的可操作性。(2)在對蛋白-多糖微粒進一步包封(即可降解緩釋微球的制備)時避免多糖微粒的溶解以及水-油界面的出現(xiàn)。本研究將文獻記載的“水包油、油包固體”(S/O/W)微球制備方法進行了改進,將作為使微球得以形成的水溶液連續(xù)相改為不溶多糖的配方稱之為親水“油相”(hydrophilic“oil phase”,下文中以hO標示),使S/O/W方法變?yōu)镾/O/hO方法。這一

7、方法避免了微球制備過程中蛋白-多糖微粒的溶解和溶出(從而提高了包封率),避免了水-油界面,當然也避免了溶解后的蛋白和水-油界面的接觸這一造成蛋白變性失活的最主要原因。這一方法還避免了文獻中所謂的“油包固體、油包油”(S/O/O)的方法中用有機溶劑清洗油相的過程。清洗過程中需用大量有機溶劑,造成安全和環(huán)境的隱患。(3)通過在緩釋高分子基質中分散的多糖的性質(大分子量、親水性、吸水后的黏度)使被環(huán)繞在其中的蛋白減少聚集和在高分子基質上的吸附

8、從而降低不完全釋放；通過對可降解高分子組成的調(diào)節(jié),使微球形成“殼-核”結構,蛋白多糖顆粒被集中于核結構部分而降低了初期突釋；改善了釋放動力學。本研究利用模型蛋白(肌紅蛋白、牛血清白蛋白、半乳糖苷酶)對上述微球制備技術進行了一系列考察。對這些蛋白-葡聚糖微粒的密度、XRD及DSC測試證明其為玻璃態(tài)。將半乳糖苷酶(β-Gal)這樣一個具有四級結構的蛋白大分子作為模型包封于葡聚糖顆粒,在有機溶液中渦旋振蕩、離心、回收酶的催化活性保持在90%以

9、上,證明了多糖玻璃體包封蛋白對于蛋白的保護作用。本研究進一步通過光學及電子顯微鏡的觀察確認了微球的圓整的形狀、光滑的表面以及殼-核結構；通過模型蛋白(牛血清白蛋白BSA,肌紅蛋白MGB)的緩釋實驗考察了微球制備工藝及其對蛋白緩釋動力學的影響,優(yōu)化了微球的組成和制備工藝,實現(xiàn)了80%以上的包封率和接近于零級的釋放曲線；通過體積排阻色譜(SEC-HPLC)測試確認了包封在微球中的蛋白基本上不發(fā)生聚集。在方法優(yōu)化成功的基礎上,本研究嘗試了將這

10、一制劑技術用于蛋白藥物重組人生長素的緩釋微球制備,在初步實驗中得到了理想的結果。制備微量的微球實現(xiàn)理想的包封率、不發(fā)生聚集和較好的體外釋放曲線,及在大鼠體內(nèi)的較平緩的血藥濃度。蛋白-多糖微粒對有機溶劑的高度耐受性使之不僅可以用來制備可注射的緩釋微球,還可用以制備具有藥物治療功能的治療器械。本研究將載有蛋白(BSA、粒細胞集落刺激因子,即G-CSF)的多糖微?；鞈矣诳山到飧叻肿尤芤翰⑼繉佑谛呐K支架和止血紗布的表面。隨即將涂層洗脫,回收蛋白

11、,通過SEC-HPLC和細胞NFS-60作用對蛋白的聚集體和細胞增值活性進行了考察。蛋白樣品保持了單體形態(tài)和80%的細胞NFS-60增殖活性(G-CSF)。蛋白可以從涂層的較緩慢的釋放。針對蛋白大分子緩釋技術中的一系列難題,逐一提出并且驗證了新的解決方案,特別是對一系列單一問題的解決方案進行了系統(tǒng)性優(yōu)化,避免了以往蛋白大分子緩釋方法的研究中由于視角不同而產(chǎn)生的顧此失彼、因果互換的現(xiàn)象。通過在幾個模型蛋白以及真正的蛋白藥物(生長素)的實驗