藥物中痕量大分子蛋白檢測方法的研究與應用.pdf

1、過敏反應在臨床上經常發(fā)生，嚴重時可致人死亡，尤以中藥注射液、注射用藥用輔料、β-內酰胺類抗生素等藥物最為突出，經研究發(fā)現，這些藥物中殘留的大分子蛋白可引起過敏反應，故為了保證用藥安全，去除這些雜質是非常重要的，藥品生產者也通過不斷的技術改進盡量去除這些大分子蛋白雜質，因此需要建立一個靈敏度高、選擇性好的方法對生產工藝進行驗證和監(jiān)測。然而由于這些藥物生產過程復雜，大分子蛋白在生產過程中可能發(fā)生一系列的聚合、裂解等反應，故不適合用基于抗體-

2、抗原反應的檢測特異性活性蛋白的免疫法對其進行測定，也不適合使用基質影響大、靈敏度低的傳統(tǒng)的光譜法對其進行檢測，故建立一個準確度高、特異性好、靈敏度高的蛋白檢測方法是藥物分析者面臨的一個難題。
　　中藥注射液中的植物蛋白等大分子雜質易隨提取過程殘留到終產品中，本文以茵梔黃注射液為研究對象，針對中藥注射液成分復雜但大多是小分子這一特性，利用根據分子量大小對化合物進行分離的高效凝膠排阻色譜法（HPSEC）分析技術對其中的大分子蛋白含量進

3、行了研究，為了進一步提高靈敏度，優(yōu)選了檢測波長，選取蛋白吸收更高的末端吸收作為檢測波長。色譜柱為 TSK gel SuperSW2000色譜柱（4μm,4.6×300 mm），流動相為磷酸鹽緩沖溶液，流速為0.3 mL/min，紫外檢測波長為220 nm，樣品溶液經過濾后可直接進樣，結果該方法在0.312-40.0μg/mL線性范圍內關系良好（R2=0.999），回收率均大于81％，重復性良好，RSD為0.6%，檢測限可以達到0.104

4、μg/mL，靈敏度比常用的測定蛋白的靈敏度最高的方法考馬斯亮藍法（Bradford）還提高了10倍左右，且只對樣品進行簡單處理即可進行分析，結果表明，該方法操作簡便快速，重現性好，為其他同類藥物中的大分子雜質的檢測提供了一種可借鑒的分析手段。
　　注射用乳糖是注射用藥物生產中一種很好的藥用輔料，但是由于乳糖來源于動物乳清，可能會殘留有微量乳清蛋白引起過敏反應，故需要對其中的乳清蛋白進行嚴格控制。本研究同時建立了 HPSEC法和超高

5、效液相色譜-四級桿飛行時間串聯質譜（UPLC-Q-TOF）兩種方法對乳糖中的α-乳白蛋白及β-乳球蛋白進行檢測，HPSEC法使用的色譜柱為 TSK gel SuperSW2000色譜柱（4μm,4.6×300 mm），流動相為磷酸鹽緩沖溶液，流速為0.3 mL/min，紫外檢測波長為220 nm，結果該方法在α-乳白蛋白和β-乳球蛋白總濃度3.40~68.0μg/mL的范圍內線性關系良好，回收率均大于87%，重復性良好，RSD為0.5%

6、，檢測限為1.13μg/mL，結果表明本研究建立的HPSEC法靈敏度較 UPLC-Q-TOF法稍高，且該方法操作簡單快速，成本相對較低，適用性更廣，易于普及，但由于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分子量接近，在 HPSEC色譜柱中不能完全分離，故不能分別對二者進行定量，只能測定二者含量總和。UPLC-Q-TOF法以0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液和0.1%TFA乙腈溶液為流動相進行梯度洗脫，經蛋白柱分離后，采用飛行時間質譜檢測器（TOF）進行

7、全離子掃描模式檢測。應用 Peakview1.2分析軟件，通過對化合物離子精確質荷比、特征二級質譜以及保留時間的比對，對目標物進行驗證。α-乳白蛋白和β-乳球蛋白測定的線性范圍分別在2.00~80.0μg/mL和6.00~240.0μg/mL之間，相關系數為0.997和0.996;檢測限分別為1.00μg/mL和3.00μg/mL;加樣回收率分別為82.9%~87.2%和96.1%~98.4%。結果表明，本方法特異性好，結果準確，但對蛋

8、白直接測定靈敏度并不高。故在實際檢測中，若需要操作簡單快速，成本較低，靈敏度高且需對兩種蛋白總和進行檢測時可選用HPSEC法；若需要對蛋白特異性要求較高，對蛋白分別進行鑒定和檢測且靈敏度要求不高時可采用 UPLC-Q-TOF；若需要對蛋白特異性要求較高且靈敏度要求也較高時，可對 UPLC-Q-TOF法前處理進一步研究，使大分子裂解成分子量較小的化合物再進行檢測。
　　青霉素類等β-內酰胺類抗生素因其發(fā)酵工藝，易產生并殘留大分子蛋白

9、，本研究以青霉素 V鉀為模型藥物，建立了一個中空纖維離心超濾（HFCF-UF）裝置對蛋白大分子進行分離和富集，然后經末端吸收的HPSEC法對大分子進行分析測定。色譜柱為TSK gel SuperSW2000色譜柱（4μm,4.6×300 mm），流動相為磷酸鹽緩沖溶液，流速為0.3 mL/min，紫外檢測波長為220 nm，樣品溶液經 HFCF-UF一步離心富集可直接進樣，并對非特異性吸附（NSB）現象進行了考察。結果該方法富集倍數高達