熒光信號放大檢測技術(shù)在生物大分子檢測中的研究和應(yīng)用.pdf

1、多年來,人們一直致力于發(fā)展和完善生物大分子的研究和分析方法,使其更加靈敏、精確、便捷、經(jīng)濟,以滿足各個領(lǐng)域?qū)ζ湓絹碓礁叩囊蟆Ｉ锓肿有盘柗糯髾z測技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種利用各種工具酶和納米顆粒等手段,并結(jié)合電化學、光學、壓電等技術(shù)的高靈敏檢測方法,可實現(xiàn)對生物分子的直接高靈敏檢測,是生物分析科學領(lǐng)域中的一個研究重點和熱點。如何利用現(xiàn)有分子生物學技術(shù)和手段將生物分子的含量、相互作用等信息實時、靈敏、特異地轉(zhuǎn)化為易于檢測的物理量并拓展其

2、在分子生物學及生物醫(yī)學中的應(yīng)用,如何設(shè)計新的信號轉(zhuǎn)換手段和建立新的生物分子信號放大檢測技術(shù)平臺來解決生命研究過程中的新問題,仍然是生物醫(yī)學和分析化學工作者所面臨的重大科學問題。
　　 本論文以上述科學問題為目標,以核酸和蛋白質(zhì)這兩類組成生命的最主要生物大分子為研究對象,利用多種核酸工具酶和熒光核酸探針技術(shù),建立了一系列簡便、快速的生物大分子熒光信號放大檢測技術(shù)平臺,在核酸定量分析、點突變(point mutation)檢測、多重

3、單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)基因分型和蛋白質(zhì)的的分析方面得到重要應(yīng)用。主要內(nèi)容歸納如下:
　　 1、基于接近連接效應(yīng)的滾環(huán)擴增(Rolling Chain amplification,RCA)方法的建立及用于點突變的高靈敏檢測。滾環(huán)擴增技術(shù)由于具有高靈敏、高特異性和等溫操作等諸多優(yōu)點,在生物化學分析和臨床醫(yī)學診斷中有很好的應(yīng)用前景,但同時也存在著用于擴增的模板-掛鎖探

4、針的合成難的問題,限制了滾環(huán)擴增技術(shù)的廣泛應(yīng)用。本部分在普通的滾環(huán)擴增技術(shù)基礎(chǔ)上,利用接近連接效應(yīng)原理,建立了一種滾環(huán)擴增模板-掛鎖探針合成的新方法。該方法不但解決了普通滾環(huán)檢測技術(shù)中存在的長片段DNA合成難和成本高的問題,而且提高了線性片段成環(huán)的效率,為滾環(huán)擴增的進一步廣泛應(yīng)用提供了幫助,并利用該方法合成的掛鎖探針進行滾環(huán)擴增實現(xiàn)了對基因點突變的高靈敏檢測。
　　 2、基于分子信標的等溫循環(huán)鏈置換聚合酶反應(yīng)的熒光信號放大技術(shù)用

5、于核酸的檢測。利用特殊設(shè)計的長臂分子信標作為聚合酶反應(yīng)的模板和檢測探針,在靶核酸分子與分子信標雜交中引發(fā)引物與分子信標臂部退火,在DNA聚合酶存在下產(chǎn)生循環(huán)的鏈置換聚合酶反應(yīng),從而實現(xiàn)了對靶核酸的熒光信號循環(huán)放大檢測。該技術(shù)以靶DNA誘發(fā)鏈置換聚合酶反應(yīng)的循環(huán)發(fā)生來實現(xiàn)信號放大,而無需直接擴增靶DNA分子,避免了反應(yīng)產(chǎn)物污染,并且設(shè)計簡單、操作簡便快捷、在等溫條件下反應(yīng),靈敏度高,檢測下限可達6.4fmol/L,為核酸定量分析和病毒檢測

6、提供了一種簡單、快速、高靈敏的熒光信號放大分析方法,有望在病毒檢測分析等方面得到廣泛的應(yīng)用。
　　 3、基于切刻酶介導的循環(huán)鏈置換聚合反應(yīng)用于多重SNPs的熒光信號放大檢測。癌癥、心腦血管疾病和精神性疾病等復雜疾病均由多個SNPs相互作用引起,因而在關(guān)聯(lián)分析研究中同時對多個SNPs進行基因分型和檢測已成為多基因復雜性狀疾病的遺傳易感性研究的重要技術(shù)手段。目前基于雜交穩(wěn)定性的差異或點突變引起的酶反應(yīng)速度差異的多重SNPs基因分型和

7、檢測方法具有分析點突變差異不顯著的缺點,并同時很難將多個SNPs等位基因完全有效地分開,且沒有信號放大檢測的過程。本部分設(shè)計合成了分別帶信號識別序列、酶切位點和引物識別序列的等位基因核酸探針,通過連接酶反應(yīng),巧妙結(jié)合切刻內(nèi)切酶和聚合酶反應(yīng),建立了一種等溫、快速、高靈敏和高特異的等溫循環(huán)熒光信號放大的多重SNPs檢測技術(shù)平臺。該方法同時將多重SNPs基因的點突變信號準確轉(zhuǎn)換為了多種具有顯著差異、并可循環(huán)生成的單鏈DNA信號識別序列分子,并

8、與帶不同熒光標記的分子信標識別,獲得不同的熒光信號,從而準確實現(xiàn)了對多重SNPs的信號放大檢測。該檢測平臺克服了現(xiàn)有檢測方法的缺陷,操作簡單,等溫反應(yīng),既能準確判斷SNPs,又能將檢測信號進行放大,還能對多個SNPs等位基因同時進行分析,為相關(guān)疾病篩查和臨床診斷、防治和手術(shù)預后監(jiān)測提供了一種新的強有力手段。
　　 4、利用雙鏈熒光核酸適體探針建立了簡便快速的蛋白質(zhì)的熒光分析方法。核酸適體因能高效、特異地結(jié)合各種配體和具有易合成、

9、易修飾等特點,在蛋白質(zhì)檢測方面具有廣泛的應(yīng)用前景。本部分基于結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換信號核酸適體探針的設(shè)計,發(fā)展了一種新的基于雙鏈熒光核酸適體探針的蛋白質(zhì)檢測方法。該方法對蛋白質(zhì)的線性響應(yīng)范圍為6.0～100.0nmol/L,檢測下限為6.0nmol/L。該方法對核酸適體探針的空間結(jié)構(gòu)和與靶標的結(jié)合位點沒有特殊的限制和要求,設(shè)計簡單,操作方便,有望為基于核酸適體探針的靶物質(zhì)檢測提供一種簡便、快速的通用檢測平臺。
　　 5、基于發(fā)夾型核酸適體探針

10、和聚合酶反應(yīng)的熒光信號放大檢測技術(shù)用于蛋白質(zhì)檢測。核酸分子由于可借助各種工具酶來檢測,因而其檢測方法遠比傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測方法靈敏和特異。通過檢測核酸來定量蛋白質(zhì),一直是人們研究的熱點和重點。本部分設(shè)計了一種新型的發(fā)夾型核酸適體探針,利用其與靶蛋白反應(yīng)后構(gòu)象發(fā)生變化的特點,建立了一種基于聚合酶反應(yīng)的熒光信號放大的蛋白質(zhì)檢測新方法。該發(fā)夾型核酸適體被設(shè)計成蛋白質(zhì)配體和聚合酶反應(yīng)模板,當?shù)鞍踪|(zhì)與核酸適體特異性結(jié)合后,探針的構(gòu)象由發(fā)夾型轉(zhuǎn)變?yōu)榫€

11、型,成為聚合酶反應(yīng)的模板,在引物和聚合酶作用下啟動聚合酶反應(yīng),聚合酶反應(yīng)的進程被熒光染料實時轉(zhuǎn)換為熒光信號,實現(xiàn)了在未直接標記核酸適體的情況下檢測蛋白質(zhì),同時由于聚合酶的鏈置換活性,使誘導發(fā)夾型核酸適體構(gòu)象變化的靶蛋白能在聚合酶反應(yīng)中被置換出來,重新誘導下一輪的聚合酶反應(yīng),從而可實現(xiàn)對靶蛋白的循環(huán)放大檢測,對蛋白質(zhì)的線性響應(yīng)范圍為0.5～8.0nmol/L,檢測下限為0.5nmol/L。該方法無須直接標記核酸適體探針、對核酸適體的空間結(jié)