熒光光譜技術(shù)在生物大分子相互作用以及解旋酶酶促反應研究中的應用.pdf

1、本研究選取當前生物學領域中廣泛采用的熒光光譜檢測技術(shù)(如：熒光交聯(lián)相關光譜技術(shù)，F(xiàn)CCS；熒光偏振檢測技術(shù)，F(xiàn)lorescence anisotropy以及熒光強度衰退檢測技術(shù)，Photoluminescence decay)并深入開展其在生物大分子相互作用機制中的應用研究，研究結(jié)果與結(jié)論如下：
　　 一.熒光交聯(lián)相關光譜技術(shù)及其在RecQ解旋酶活性作用研究中的應用實驗選用雙熒光標記互補鏈小片斷寡聚核苷酸鏈作為研究底物，利用熒光

2、交聯(lián)相關光譜(Fluorescence Cross-Correlation Spectroscope，F(xiàn)CCS)熒光檢測技術(shù)實時監(jiān)控大腸桿菌RecQ以及人類RecQ5β解旋酶蛋白的酶促反應活性。結(jié)果表明熒光交聯(lián)相關光譜技術(shù)FCCS適用于實時監(jiān)測RecQ解旋酶蛋白的酶促反應活性。且該檢測體系具有較高的靈敏性與穩(wěn)定性。
　　 1)應用FCCS技術(shù)監(jiān)測E.Coli RecQ解旋酶蛋白的雙鏈DNA解鏈活性
　　 本實驗選取高度保

3、守的大腸桿菌E.Coli RecQ解旋酶(Xu et al.，2003)作為研究對象，并采用FCCS技術(shù)作為檢測手段，監(jiān)測E.Coli RecQ蛋白的酶促反應活性。研究結(jié)果表明：在一級反應條件下，E.Coli RecQ蛋白對底物的作用方式具有溫度依賴性：此外，DNA底物核苷酸鏈的長度也會影響蛋白對底物的協(xié)同作用程度，進而引發(fā)酶促反應活性的顯著差異。在多極反應條件下，DNA底物鏈長度不會影響酶蛋白對底物協(xié)同作用效應，主要由于反應體系中底物

4、濃度遠遠大于酶蛋白濃度，該結(jié)果再次印證了一級反應條件下蛋白酶促活性的差異是由于酶蛋白對底物協(xié)同作用效應差異而引起的。
　　 2)應用FCCS技術(shù)監(jiān)測RecQ5β解旋酶蛋白的互補單鏈DNA鏈“退火”活性
　　 本研究采用FCCS技術(shù)作為檢測手段，監(jiān)測人類RecQ5β解旋酶蛋白的酶促反應活性。研究結(jié)果表明RecQ5β酶蛋白能夠引發(fā)互補單鏈DNA鏈“退火”反應，且該反應活性與DNA底物鏈長度無關。通過研究RecQ5β酶蛋白在不

5、同孵育溫度下對DNA的底物親和力，結(jié)果表明RecQ5β酶蛋白對底物DNA結(jié)合能力不受孵育溫度的影響，進而印證了較高溫度下較強的互補單鏈DNA鏈“退火”程度歸因為RecQ5β酶蛋白自身具有的酶促反應活性。該研究還檢測了反應體系中鎂離子濃度對互補單鏈DNA鏈“退火”程度的影響，結(jié)果表明人類RecQ5β解旋酶蛋白的互補單鏈DNA鏈“退火”活性不具有鎂離子依賴性。
　　 二.穩(wěn)態(tài)熒光偏振檢測技術(shù)在HIV病毒整合酶蛋白酶促反應活性研究中的

6、應用
　　 本研究采用穩(wěn)態(tài)熒光偏振檢測儀Beacon2000(PanVera，Madison，WI)來實時監(jiān)控HIV病毒整合酶蛋白與底物DNA結(jié)合過程中穩(wěn)態(tài)偏振熒光數(shù)值的變化。本試驗研究了兩類主要的針對HIV病毒復制以及重組HIV整合酶蛋白催化特性的遺傳抑制通路(N155H以及G140S/Q148H)。該研究采用穩(wěn)態(tài)熒光偏振檢測技術(shù)，成功實時監(jiān)測了野生型以及突變型HIV整合酶蛋白的DNA結(jié)合活性以及3’端處理活性。結(jié)果表明N15

7、5H，G140S，Q148H以及G140S/Q148H每種整合酶遺傳突變體都會對整合酶蛋白活性產(chǎn)生抑制作用，然而抑制程度依據(jù)突變類型的不同存在不同程度的芹異。其中Q148H突變在單獨存在的情況下對抗病毒藥物RAL具有最強的抗藥性；G140S則表現(xiàn)出較弱的抗藥性；然而G140S/Q148H雙重突變體卻表現(xiàn)出極強的抗藥性，且此時病毒復制水平類似于野生型HIV病毒。但是研究表明Q148H突變不僅抑制了重組病毒整合酶的催化活性，同時該突變體也嚴

8、重抑制了病毒的復制能力。盡管G140S未表現(xiàn)出強烈的抗藥性，但該突變可以幫助Q148H突變體恢復病毒復制能力。這與體外試驗研究結(jié)果一致：即G140S/Q148H雙重突變體能夠恢復至野生型病毒整合酶的活性，但Q148H單突變體不具備該能力。該結(jié)果很好的詮釋了為何艾滋病患者在服用RAL抗病毒藥物后體內(nèi)會很快形成G140S/Q148H雙重突變整合酶。本研究還表明較之N155H突變體，Q148H突變體具有更強的抗RAL抗藥性，進而解釋了為何艾滋

9、病患者在服用RAL抗病毒藥物后體內(nèi)的N155代謝通路會很快轉(zhuǎn)變?yōu)镼148H代謝通路。
　　 三.熒光強度衰減檢測技術(shù)在納米量子點熒光特性研究中的應用
　　 本試驗采用熒光衰減檢測技術(shù)以及常用的光譜技術(shù)來研究實驗室合成的具有MPA外殼CdTe納米量子點熒光特性。分析了量子點體積依賴性和溫度依賴性相關的時間相關熒光衰減特征曲線，結(jié)果表明：最小體積納米量子點(直徑約為2納米)的激發(fā)光譜在較長的波長處具有一個小峰值。CdTe量子

10、點的熒光壽命峰值分布在0.1ns，1-3ns，10-20ns以及40-50 ns。此外，研究結(jié)果表明量子點體積越大，其熒光壽命衰減越慢。且熒光壽命的數(shù)值在單光子激發(fā)與雙光子激發(fā)情況下無顯著差異。溫度梯度研究結(jié)果表明，在較高溫度下，納米量子點的熒光衰減壽命越慢。上述研究結(jié)果表明納米量子點的熒光光譜特性相當復雜，且與量子點的體積大小密切相關。因而量子點在熒光共振能量轉(zhuǎn)移研究技術(shù)中的應用需要多階分析函數(shù)模型的輔助。納米量子點表面電荷對其熒光衰