小G蛋白StRac在馬鈴薯抗晚疫病過(guò)程中的功能研究.pdf

1、小G蛋白是一類GTP結(jié)合蛋白，具有GTPase活性。大量的研究表明小G蛋白與其下游元件共同作用可以調(diào)控肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力、細(xì)胞形態(tài)建成、細(xì)胞極性的生成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、活性氧產(chǎn)生等多種生命活動(dòng)。馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉侵染而引起的一種毀滅性病害。本研究從馬鈴薯中克隆到小G蛋白StRac，通過(guò)超量表達(dá)和內(nèi)源StRac基因的沉默研究StRac在馬鈴薯抵抗晚疫病菌侵染過(guò)程中的功能，具體的研究結(jié)果如下:
　　1.利用煙草中已經(jīng)克隆到的小G

2、蛋白NtRac4的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用RT-PCR結(jié)合3'和5'Race的方法從馬鈴薯cDNA中克隆到了馬鈴薯小G蛋白StRac。StRac cDNA全長(zhǎng)633bp，與煙草的NtRac4基因核苷酸的同源性是95.7％，蛋白的同源性是99％。StRac翻譯后可得到211個(gè)氨基酸，分子量為23.29KD。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明StRac蛋白有1個(gè)效應(yīng)子結(jié)合區(qū)，1個(gè)鳥(niǎo)苷酸交換因子結(jié)合區(qū)(GEF)，1個(gè)GTP水解酶結(jié)合區(qū)(GAP)，1個(gè)鳥(niǎo)

3、苷酸分離抑制子結(jié)合區(qū)(GDI)，1個(gè)Mg2+離子結(jié)合效應(yīng)區(qū)，還有2個(gè)交換區(qū)和5個(gè)G Box區(qū)域。這些結(jié)構(gòu)域以β折疊和α螺旋的形式存在于StRac蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中。利用軟件EXPASY對(duì)其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的保守功能域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)從2-179氨基酸位置有一個(gè)保守的Rho功能域，這也預(yù)示著StRac和Rho家族的小G蛋白的具有相似的功能。
　　2.StRac在馬鈴薯中表達(dá)譜的研究結(jié)果表明在不同馬鈴薯品種中StRac的表達(dá)量存在差異，夏坡蒂

4、(XPD)中StRac的相對(duì)表達(dá)量最高，其次為虎頭(HT)和大西洋(DXY);隨后為紫花白(ZHB)和底西瑞(Desiree);烏盟601(WM601)中的相對(duì)表達(dá)量最低。同一品種的不同組織中StRac的表達(dá)譜也存在差異，在幼嫩葉片中表達(dá)量最高，其次為老葉片，莖中表達(dá)量位居老葉之后，根中的表達(dá)量最低。
　　3.利用GFP標(biāo)簽進(jìn)行亞細(xì)胞定位的結(jié)果表明，不論是在煙草的表皮細(xì)胞還是馬鈴薯的懸浮細(xì)胞，StRac蛋白主要定位于細(xì)胞膜上。

5、r>　　4.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果表明:在瞬時(shí)表達(dá)CAStRac（激活型）位點(diǎn)接種晚疫病菌后病斑面積明顯小于空載體p1300-GFP與StRac（野生型），而表達(dá)DNStRac（失活型）位點(diǎn)接種后的病斑面積最大。DAB染色的結(jié)果表明CAStRac瞬時(shí)表達(dá)位點(diǎn)病斑小的原因是由于H2O2在此位點(diǎn)的大量積累。這一結(jié)果預(yù)示著StRac在調(diào)控馬鈴薯抗晚疫病過(guò)程介入了H2O2信號(hào)分子。
　　5.為了進(jìn)一步確定StRac在馬鈴薯抗性建立過(guò)程

6、中的功能，我們通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法得到轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。經(jīng)過(guò)PCR、RT-PCR、蛋白免疫印跡檢測(cè)，確定獲得轉(zhuǎn)基因植株中能夠穩(wěn)定表達(dá)StRac基因。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的不同株系接種晚疫病后發(fā)現(xiàn)，CAStRac轉(zhuǎn)基因植株的病斑面積小于p1300-GFP與StRac（野生型）。壞死細(xì)胞染色的結(jié)果表明CAStRac轉(zhuǎn)基因植株葉片接種后壞死細(xì)胞數(shù)量明顯小于StRac（野生型）、DNStRac（失活型）和空載體對(duì)照(p1300-GFP)。這一結(jié)果預(yù)示著超表

7、達(dá)CAStRac能夠提高馬鈴薯對(duì)晚疫病菌的抗性。
　　6.為了解析超表達(dá)CAStRac能夠提高馬鈴薯對(duì)晚疫病菌的抗性的原因，我們首先檢測(cè)了不同轉(zhuǎn)基因植株接種前后H2O2的積累。DAB染色的結(jié)果表明接種后CAStRac植株中H2O2積累的水平明顯高于StRac（野生型）、DNStRac（失活型）和空載體對(duì)照(p1300-GFP)。H2O2定量測(cè)定的結(jié)果表明接種后CAStRac植株中H2O2的積累的水平最高，而StRac（野生型）、D

8、NStRac（失活型）和空載體對(duì)照(p1300-GFP)接種后H2O2積累水平相近。接菌前后對(duì)和H2O2清除相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)的結(jié)果表明，穩(wěn)定表達(dá)CAStRac的植株在接菌后SOD、APX及CAT基因的轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，并在48h表達(dá)出現(xiàn)峰值。而DNStRac植株接種后SOD、APX及CAT基因轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)出降低的態(tài)勢(shì)。StRac（野生型）和空載體對(duì)照(p1300-GFP)接種后SOD、APX及CAT基因轉(zhuǎn)錄水平變

9、化趨勢(shì)相近，均為先降低后升高，但是峰值點(diǎn)均低于CAStRac轉(zhuǎn)基因植株。
　　7.為了更進(jìn)一步的確定StRac在馬鈴薯抗性建立過(guò)程中的功能，我們構(gòu)建了StRac和內(nèi)參基因pds的病毒沉默載體。利用內(nèi)參基因pds優(yōu)化了病毒介導(dǎo)的基因沉默的接種方法和比較了沉默載體在不同馬鈴薯品種中的沉默效率。利用優(yōu)化的沉默體系對(duì)烏盟601中StRac進(jìn)行了沉默。通過(guò)人工接種檢測(cè)沉默植株對(duì)晚疫病的抗性水平的結(jié)果表明接種晚疫病后，StRac沉默的葉片上病