馬鈴薯晚疫病菌四個(gè)RxLR基因的功能鑒定.pdf

1、馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉菌(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起，能夠?qū)е埋R鈴薯的大幅減產(chǎn)，甚至絕收，嚴(yán)重威脅著馬鈴薯生產(chǎn)，被視為國際第一大作物病害。其病原菌在與植物協(xié)同進(jìn)化的過程中，會(huì)分泌豐富的RxLR類效應(yīng)分子，發(fā)揮了不同的致病作用，成為侵染的“武器”；同時(shí)，植物免疫系統(tǒng)進(jìn)行防衛(wèi)反應(yīng)形成“盾”，目前鑒定的抗晚疫病基因，其識別的無毒基因也都屬于病原菌RxLR類分泌蛋白。由于馬鈴薯栽培品種是四倍

2、體作物，自交不親和，通過雜交的方法將野生種中鑒定的抗病基因?qū)氲皆耘嗥贩N從而獲得抗病效果的策略只能在有限的資源中利用。因此，從野生種質(zhì)資源中鑒定抗晚疫病基因并利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因抗病馬鈴薯品種成為重要的防治策略之一。
　　龍葵作為馬鈴薯晚疫病非寄主茄科植物，對馬鈴薯晚疫病菌具有很好的抗性，預(yù)測攜帶相應(yīng)的抗病基因資源。本研究通過構(gòu)建我國A1融合群晚疫病黑龍江分離菌株HLJ1的RxLR蛋白基因池，進(jìn)而在非寄主龍葵上篩選候選無毒基

3、因并進(jìn)行分析，幫助解釋非寄主抗性的遺傳基礎(chǔ)并后續(xù)幫助從龍葵中克隆抗病基因。目前，取得的研究成果包括以下幾點(diǎn)：
　　1.參考已測序菌株T30-4基因組序列，以HLJ1菌株的gDNA為模板，通過高保真PCR，成功克隆并構(gòu)建251個(gè)RxLR效應(yīng)因子的瞬時(shí)表達(dá)載體。利用生物信息學(xué)手段分析兩個(gè)菌株T30-4和HLJ1基因組中RxLR分子的多態(tài)性，除了8個(gè)基因在部分菌株中存在等位基因缺失外，其它RxLR效應(yīng)分子存在對應(yīng)的等位基因。等位基因之間

4、編碼氨基酸序列完全相同數(shù)量相對較多，部分基因存在不同數(shù)量的多態(tài)性。
　　2.為研究 RxLR效應(yīng)因子的功能，利用PVX介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)將構(gòu)建的RxLR效應(yīng)子分別在本氏煙和龍葵上進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，篩選得到3個(gè)僅能在龍葵上觸發(fā)過敏性壞死（HR）的基因，作為候選抗性無毒基因（Pi15718、Pi15556、Pi21190）。通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因在 HLJ1侵染過程中表達(dá)量都出現(xiàn)明顯變化。通過對這3個(gè)RxLR效應(yīng)分子的功能結(jié)構(gòu)域的

5、截短分析發(fā)現(xiàn)，確定其與龍葵識別產(chǎn)生HR的關(guān)鍵區(qū)域都在C-端。
　　3.進(jìn)一步解析 Pi15718的功能，對其在10個(gè)晚疫菌株中的多態(tài)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)存在兩種類型的氨基酸序列，其中Pi15718HLJ1類可以在除龍葵品種（SN005）外的其他測試的龍葵上均產(chǎn)生 HR，Pi1571888069類不能在龍葵上產(chǎn)生 HR。推測氨基酸改變影響其在龍葵上產(chǎn)生HR的功能。有意思的是，Pi1571888069和Pi15718HLJ1的C末端單獨(dú)可以

6、激發(fā)龍葵的HR，暗示Pi1571888069N-端具有抑制C-端激活龍葵HR的功能。酵母雙雜交驗(yàn)證N-端并不與C-端發(fā)生蛋白的互作。N-端抑制功能的關(guān)鍵位置確定在Pi1571888069的第45-52位的氨基酸之間。同時(shí)，為研究該候選無毒基因的功能，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系以及酵母雙雜交篩選互作蛋白的工作也在進(jìn)行中。
　　4.針對候選無毒基因Pi15556，研究發(fā)現(xiàn)在15個(gè)晚疫菌株中高度保守，氨基酸序列完全一致。其在供測的龍葵樣本 SN0

7、04、SN005、SN008中也不激發(fā) HR，體現(xiàn)無毒基因的特征。為了研究其在菌株中的功能，構(gòu)建Pi15556的抑制突變體菌株，在鑒定了突變率分別為61.9％和34.7%的突變體M-1和M-2。對突變體進(jìn)行生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Pi15556并不影響菌落形態(tài)，菌絲生長和孢子囊形態(tài)，但預(yù)測可能通過影響產(chǎn)孢能力影響致病性。
　　5.Pi21190也有類似結(jié)果，在不同的龍葵材料中分別可激發(fā)或者不激發(fā) HR反應(yīng)，體現(xiàn)無毒基因的特征。同時(shí)，其在不同

8、菌株中存在不同的等位基因，但其等位基因在龍葵SN0022上均產(chǎn)生HR，體現(xiàn)較強(qiáng)的保守性。
　　6.同期篩選到一個(gè)可以在本氏煙上抑制 INF1產(chǎn)生 HR的RxLR效應(yīng)分子 Pi14684進(jìn)行等位基因的多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)其存在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的改變，在本氏煙上瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果證明E43K，是其抑制INF1產(chǎn)生HR的關(guān)鍵位點(diǎn)。隨后為了研究Pi14684是否特異性的抑制INF1產(chǎn)生HR，分別接種SFI2，Avr3aKI和R3a混合菌液，發(fā)現(xiàn)Pi1