脾臟通過上調(diào)肝PTEN-Akt通路延緩大鼠NAFLD發(fā)展.pdf

1、背景:脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，脾臟在機(jī)體免疫、抗感染、血液濾過等方面起著重要的作用，從脾切除術(shù)后兇險(xiǎn)性感染的發(fā)現(xiàn)開始，脾臟越來越得到人們的重視，脾臟對(duì)機(jī)體其他方面的重要作用也漸漸被發(fā)現(xiàn)。研究顯示脾臟在機(jī)體脂質(zhì)代謝中起著重要作用，脾臟可以降低血脂水平，脾切除術(shù)后血脂水平升高。酒精性脂肪性肝病(NAFLD)以肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積為主要特征，包括簡單肝細(xì)胞脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及其發(fā)展到嚴(yán)重階段的肝硬化甚至肝癌發(fā)生等一系列

2、肝臟疾病表現(xiàn)。流行病學(xué)顯示NAFLD在全球，尤其是發(fā)達(dá)國家的患病率越來越高，已成為嚴(yán)重危害人類健康的殺手。脾臟跟肝臟解剖學(xué)上相鄰，脾臟在許多肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，脾臟分泌的生物活性物質(zhì)可通過門靜脈血流進(jìn)入肝臟，影響肝臟疾病的進(jìn)展與預(yù)后，比如脾源性的TGF-beta在脾臟促進(jìn)肝纖維化發(fā)展過程中起著重要作用。研究顯示，非酒精性脂肪性肝病的大鼠模型中行脾臟切除的大鼠肝臟脂肪變、肝組織甘油三酯及一些不飽和脂肪酸含量明顯高于假手術(shù)

3、組。這說明，在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中，脾臟起到了減緩進(jìn)展的作用，切除脾臟后NAFLD進(jìn)展加快。但其作用機(jī)制還不清楚。PTEN基因即第十號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因，PTEN起始作為一個(gè)有酶活性的抑癌基因被認(rèn)識(shí)，但近年來，由于其編碼的PTEN蛋白具有強(qiáng)大的磷酸酶活性，關(guān)于PTEN的研究及論述早已不再局限于一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。PTEN蛋白通過其脂質(zhì)磷酸酶活性去磷酸化二磷酸肌醇和三磷酸肌醇從而負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路，

4、而PI3K/Akt信號(hào)通路是包括胰島素和其他一些生長因子發(fā)揮功能及機(jī)體糖、磷脂等代謝一條關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PTEN基因的表達(dá)水平與NAFLD密切相關(guān)，首先，在NAFLD病人及動(dòng)物模型中，肝細(xì)胞PTEN水平明顯下降;其次，在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞中人為降低其PTEN基因表達(dá)水平會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)的明顯蓄積;再者，敲除PTEN基因的小鼠可自發(fā)形成嚴(yán)重的NASH。綜上，脾臟與NAFLD關(guān)系密切，但其具體機(jī)制還不清楚，脾臟可能通過影響肝PTEN基因的表

5、達(dá)與功能而影響NAFLD進(jìn)展。
　　目的:研究大鼠非酒精性脂肪性肝病進(jìn)展過程中脾臟對(duì)肝PTEN基因的表達(dá)和功能的影響，探討脾臟影響NAFLD發(fā)展可能的機(jī)制。
　　方法:1、動(dòng)物及分組清潔級(jí)SD大鼠40只，體重160-180g，大鼠分籠喂養(yǎng)，5只/籠，飼養(yǎng)環(huán)境25℃。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組:A.正常飼料+假手術(shù)組B.正常飼料+脾切除術(shù)組C.高脂飼料+假手術(shù)組D.高脂飼料+脾切除術(shù)組。高脂飼料成分:1％膽固醇+20％豬油

6、+79％基礎(chǔ)飼料。2、手術(shù)術(shù)前大鼠禁食12h，禁水8h。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(50mg/kg)后，取腹正中線稍左2cm豎切口，分兩層進(jìn)入腹腔，分離并結(jié)扎脾臟血管，完整取下脾臟，檢查無出血后分兩層關(guān)腹。假手術(shù)組只做相同開關(guān)腹處理。所有手術(shù)器械均經(jīng)高壓滅菌，手術(shù)步驟嚴(yán)格按照無菌操作要求進(jìn)行。建模后8周取大鼠肝組織及下腔靜脈血。3、實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法采用全自動(dòng)化學(xué)分析儀(Dade Behring RXL)測(cè)定血清血脂濃度;固定的肝組織石蠟包埋后，

7、4um連續(xù)切片，HE常規(guī)染色，光學(xué)顯微鏡觀察脂肪肝程度;氯仿甲醇勻漿法提取肝組織甘油三酯，按照甘油三酯濃度測(cè)定試劑盒說明書，測(cè)定甘油三酯濃度;Western blotting檢測(cè)肝PTEN蛋白及pAkt、Akt水平;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PTENmRNA水平。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗(yàn)比較兩組數(shù)據(jù)間的差異，應(yīng)用SPSS15.0軟件處理，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.A、B、C、D組大鼠體

8、重(g)分別為:371.7±15.3、369.4±17.8、398.6±15.3、406.0±19.2;肝濕重(g)分別為:12.2±3.2、11.8±2.7、14.8±3.3、15.4±3.6;肝指數(shù)(％)分別為:3.16±0.32、3.23±0.26、3.57±0.54、3.61±0.43;血清LDL濃度(mg/dL):21.7±16.40、30.01±5.21、33.09±3.76、52.27±6.24;血清TG濃度(mg/dL)

9、:67.03±6.71、70.84±7.23、90.99±7.94、97.63±9.74;血清HDL濃度（mg/dL）:21.04±5.39、23.62±4.11、20.66±3.54、24.54±3.05;血清TC濃度(mg/dL):52.2±67.03、63.51±9.35、70.72±11.95、92.71±3.93;血清VLDL濃度(mg/dL):12.45±3.13、16.81±3.35、25.99±8.19;30.27±4.

10、67;肝組織甘油三酯濃度(mg/dL):67.29±10.01、67.21±10.71、96.82±15.58、119.47±12.06。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，喂養(yǎng)高脂飼料的大鼠組與喂養(yǎng)正常飼料的大鼠組（同手術(shù)方式相比）比較:高脂飼料組大鼠體重、肝濕重、肝指數(shù)、血脂濃度及肝組織甘油三酯含量較正常飼料組明顯升高（LDH除外），高脂飼料組大鼠肝細(xì)胞脂肪變明顯，正常飼料組肝組織正常。
　　2.脾切除組與假手術(shù)組大鼠（同飼料組間）比較:A與B組比

11、較，TC、LDL、VLDL，有顯著差異(B＞A);C與D組比較，TC、LDL有顯著差異(D＞C);D組較C組肝組織甘油三酯水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而A組與B組間無差異。
　　3.A、B、C、D組PTEN基因蛋白表達(dá)水平分別為:1.249±0.606、1.226±0.625、1.041±0.054、0.695±0.055;PTEN基因mRNA水平分別為:1.352±0.690、1.289±0.166、1.192±0.061

12、、0.746±0.087;C組與A組及B組與D組比較，PTEN蛋白及mRNA水平均明顯低于后者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;進(jìn)一步檢測(cè)C、D組pAkt蛋白水平分別為:0.980±0.069、1.463±0.108; Akt蛋白水平分別為:0.920±0.065、1.121±0.031; pAkt/Akt分別為:1.224±0.098、1.500±1.159;實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:高脂飼料組大鼠中脾切除術(shù)組與假手術(shù)組比較，PTEN基因蛋白水平及mRNA水

13、平均明顯低于假手術(shù)組，而pAkt及pAkt/Akt水平則明顯高于假手術(shù)組。
　　結(jié)論:1.以豬油+膽固醇為基礎(chǔ)高脂飼料喂養(yǎng)可以導(dǎo)致大鼠血脂水平及肝組織甘油三酯含量明顯升高、肝細(xì)胞明顯脂肪變性，從而建立NAFLD模型。
　　2.脾臟在大鼠機(jī)體脂質(zhì)代謝中起著重要作用，切除脾臟會(huì)導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，引起高脂血癥。
　　3.非酒精性脂肪性肝病大鼠的肝組織PTEN蛋白及mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組大鼠明顯下降，非酒精性脂肪性肝病的