TNF-α通過上調(diào)脊髓背角NR1磷酸化表達介導(dǎo)大鼠痛覺過敏及異常疼痛.pdf

1、傳統(tǒng)的痛覺傳導(dǎo)學(xué)說認為，疼痛是經(jīng)外周，脊髓和腦中三級神經(jīng)元的傳遞，最終被機體感知的，常表現(xiàn)為不愉快的感覺或情緒體驗。在痛覺傳遞的過程中，若受到內(nèi)，外因素的影響，就會出現(xiàn)異常性的疼痛，如痛覺過敏的發(fā)生。痛覺過敏作為一種異常的疼痛，主要表現(xiàn)為對溫和的傷害性刺激敏感性增強，并可以發(fā)生于從外周到中樞的多級水平。眾所周知，谷氨酸型NMDA 受體在痛覺的突觸傳遞中發(fā)揮著重要的作用。NMDA 受體的大量開放，引起胞內(nèi)Ca2+濃度升高，是中樞敏感化發(fā)生

2、的重要基礎(chǔ)。經(jīng)典的NMDA 受體主要是由NR1和NR2兩個必須亞基構(gòu)成的，這兩個必須亞基可以受到多種因子的調(diào)節(jié)，從而引起NMDA 受體的開放或關(guān)閉。尤其是NR1亞基上的胞內(nèi)羧基端（Ser896）存在有磷酸化位點，有研究報道，該位點的磷酸化，可以調(diào)節(jié)NMDA 受體活性，易化突觸傳遞，從而參與了痛覺過敏的發(fā)生。
　　 近年來，越來越多的報道顯示，不僅僅神經(jīng)元參與了傷害性刺激的傳遞過程，膠質(zhì)細胞也在傳遞過程中發(fā)揮著巨大的作用。膠質(zhì)細胞

3、一旦被激活（如外周的炎癥刺激），可以釋放一系列促炎癥因子，如TNF-α，IL-1β，IL-6等，影響疼痛的傳遞，易化或者阻抑疼痛。有研究顯示，外周的損傷或者炎癥可以引起脊髓中膠質(zhì)細胞活化，進而快速釋放TNF-α，參與易化脊髓SH 神經(jīng)元之間的突觸傳遞。另有研究顯示，在低位腦干的RVM 區(qū)域的神經(jīng)元上， TNF-α受體TNFR1和NR1共表達，并且TNF-α釋放增多可以上調(diào)p-NR1的表達。但在脊髓水平，外周炎癥引起的TNF-α釋放增多是

4、否也可以上調(diào)p-NR1的表達，還不清楚。基于以上，我們進行如下實驗設(shè)計，以證實是否脊髓背角TNF-α和其受體TNFR1通過對NR1亞基的磷酸化作用，參與了大鼠痛覺過敏的發(fā)生。整個實驗主要包括三部分：1）通過對大鼠左后肢足底皮下注射CFA 建立外周炎性痛模型，鞘內(nèi)給予TNFR1抑制劑anti-rTNF-α，觀察大鼠熱痛反應(yīng)和左右兩側(cè)脊髓背角NR1磷酸化水平的表達；2）通過鞘內(nèi)直接給予TNFR1激動劑rTNF-α和/或TNFR1抑制劑ant

5、i-rTNF-α，觀察TNF-α增多和激活或抑制TNFR1對大鼠熱痛反應(yīng)和左右兩側(cè)脊髓背角NR1磷酸化水平的影響；3）在大鼠炎性痛模型的基礎(chǔ)上，鞘內(nèi)直接給予膠質(zhì)細胞抑制劑FC，對大鼠熱痛反應(yīng)和脊髓背角NR1磷酸化水平進行檢測。實驗動物全部采用雄性Sprague-Dawley大鼠（250-270g）進行，第一部分動物按照2×2 雙因素設(shè)計隨機分為四組：＜Saline+Vehicle＞在生理鹽水左側(cè)足底皮下注射前24h，2h，以及注射后的2

6、3h，鞘內(nèi)給予PBS（0.01M, pH 7.4, 5 μl）于腰膨大處;＜CFA+Vehicle>在CFA（0.08 ml, 40μg Mycobacterium tuberculosis）左側(cè)足底皮下注射前24h，2h 以及注射后的23h，鞘內(nèi)給予PBS 于腰膨大處；＜Saline+anti-rTNF-α>在生理鹽水（0.08 ml）左側(cè)足底皮下注射前24h，2h 以及注射后的23h，鞘內(nèi)給予TNF-α抑制劑anti-rTNF-α（

7、50fmol/ 5 μl 或70fmol/ 5 μl）于腰膨大處；＜CFA+anti-rTNF-α>在CFA 左側(cè)足底皮下注射前24h，2h 以及注射后的23h，鞘內(nèi)給予anti-rTNF-α（劑量同前）于腰膨大處。所有四組均在外周CFA 或生理鹽水注射前24h，注射后的2h和24h 進行PWL（縮足反射潛伏期）熱痛行為檢測，并對CFA 或生理鹽水腳掌注射后24h的脊髓背角（左側(cè)/右側(cè)）磷酸化NR1的表達分別進行Western Blot

8、 檢測。
　　 熱痛行為結(jié)果顯示，相較對照組＜Saline+Vehicle＞，＜CFA+Vehicle＞組在左側(cè)足底皮下注射CFA后的2h 即出現(xiàn)明顯的PWL下降，且24h后仍未出現(xiàn)恢復(fù)（P＜0.05）；而＜CFA+anti-rTNF-α>組結(jié)果顯示，無論是鞘內(nèi)給予anti-rTNF-α是較低劑量的（50fmol/ 5μl）還是較高劑量的（70fmol/ 5 μl），二者均可抑制PWL的下降，而且顯然在一定范圍內(nèi)，隨著抑制劑劑量

9、的提高，反轉(zhuǎn)PWL 減少的作用就越強。
　　 Western Blot 檢測結(jié)果顯示相較＜Saline+Vehicle＞對照組，＜CFA+Vehicle＞組CFA左側(cè)足底皮下注射后，可以引起雙側(cè)NR1磷酸化（p-NR1）表達增加（P＜0.01），但左右兩側(cè)的p-NR1的含量無明顯差異。而來自＜CFA+anti-rTNF-α>的結(jié)果顯示，當鞘內(nèi)給予70fmol/ 5 μl的anti-rTNF-α后，相較＜CFA+Vehicle＞組

10、該組雙側(cè)脊髓背角p-NR1表達水平均下調(diào)(P＜0.01)。
　　 這些結(jié)果表明：1）在CFA 誘導(dǎo)的外周炎癥痛覺過敏模型中，減少TNF-α與其受體TNFR1的結(jié)合，可以降低痛覺過敏的發(fā)生；2）脊髓背角NR-1亞基的磷酸化過程參與了CFA 誘導(dǎo)的外周炎性痛覺過敏的發(fā)生，該過程可被TNF-α抑制劑anti-rTNF-α阻斷。
　　 第二部分實驗動物也按照2×2 雙因素設(shè)計隨機分為四組：＜Vehicle+Vehicle＞在鞘內(nèi)

11、給予TNFR1激動劑Vehicle（含0.1％BSA的PBS，5 μl）前1小時，鞘內(nèi)給予TNFR1抑制劑Vehicle（0.01M, pH 7.4, 5 μl PBS)；＜Vehicle+rTNF-α＞鞘內(nèi)給予TNFR1激動劑rTNF-α（120fmol/ 5 μl）前1小時，鞘內(nèi)預(yù)先給予PBS；＜anti-rTNF-α+Vehicle＞鞘內(nèi)給予Vehicle前1小時，鞘內(nèi)給予anti-rTNF-α（70fmol，5μl）；＜anti

12、-rTNF-α+rTNF-α＞鞘內(nèi)給予rTNF-α前1小時，鞘內(nèi)給予anti-rTNF-α。所有四組將：1）在鞘內(nèi)給予rTNF-α或Vehicle后的0.5h和2h 進行PWL 熱痛行為檢測；2）鞘內(nèi)注射rTNF-α或vehicle后2h 用Western Blot技術(shù)檢測雙側(cè)脊髓背角p-NR1的表達。
　　 熱痛行為檢測提示，＜Vehicle+rTNF-α>組在鞘內(nèi)給予TNFR1激動劑rTNF-α后0.5h，相較＜Vehicl

13、e+Vehicle＞組，PWL 快速出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05），該反應(yīng)可持續(xù)2h。但是在＜anti-rTNF-α+rTNF-α>組，當鞘內(nèi)提前給予TNFR1抑制劑anti-rTNF-α后， PWL明顯恢復(fù)并接近于對照組（P＜0.05）。
　　Western Blot 結(jié)果顯示，相較＜Vehicle+Vehicle＞組， 鞘內(nèi)給予TNF-α后2h，兩側(cè)脊髓背角p-NR1的表達快速增加（P＜0.01）；但當預(yù)先鞘內(nèi)給予TNFR1抑

14、制劑anti-rTNF-α?xí)r，NR1磷酸化水平被明顯反轉(zhuǎn)（P＜0.01），而兩側(cè)脊髓背角p-NR1的表達沒有明顯差異。這說明rTNF-α可以通過激活TNFR上調(diào)脊髓背角NR-1磷酸化水平，并快速引起痛覺過敏的發(fā)生。
　　 實驗結(jié)果表明：1）鞘內(nèi)給予rTNF-α，可以快速地引起大鼠痛覺過敏，而預(yù)先鞘內(nèi)給予anti-rTNF-α可以避免或減少痛覺過敏的發(fā)生；2）鞘內(nèi)給予rTNF-α，可以快速地引起脊髓背角NR1磷酸化，而預(yù)先給予an

15、ti-rTNF-α可以有效地緩解NR1磷酸化水平的上調(diào)。
　　 第三部分實驗動物依舊按照2×2 雙因素設(shè)計隨機分為四組：＜Saline+Vehicle＞在生理鹽水左側(cè)足底皮下注射前3d，1h，鞘內(nèi)給予PBS（0.01M，pH 7.4, 5μl）于腰膨大處;＜CFA+Vehicle＞在CFA（0.08 ml, 40μg Mycobacterium tuberculosis）左側(cè)足底皮下注射前3d，1h，鞘內(nèi)給予PBS 于腰膨大處；

16、＜Saline+FC＞在生理鹽水（0.08 ml）左側(cè)足底皮下注射前3d,1h，鞘內(nèi)給予膠質(zhì)細胞抑制劑FC（1nmol, 5 μl）于腰膨大處；＜CFA+FC＞在CFA 左側(cè)足底皮下注射前3d,1h，鞘內(nèi)給予FC (劑量同前）于腰膨大處。所有四組均在外周CFA 或生理鹽水注射前24h，注射后的2h和24h分別進行熱痛行為PWL（縮足反射潛伏期）檢測，并對CFA 或生理鹽水腳掌注射后24h的脊髓背角（左側(cè)/右側(cè)）磷酸化NR1的表達分別進行

17、Western Blot 檢測。
　　 熱痛行為結(jié)果顯示，相較對照＜Saline+Vehicle＞組,＜CFA+Vehicle＞組在左側(cè)足底皮下注射CFA后2h 即出現(xiàn)明顯的PWL下降，且24h后仍未出現(xiàn)恢復(fù)（P＜0.05）；而

18、組CFA左側(cè)足底皮下注射后，可以引起雙側(cè)NR1磷酸化（p-NR1）表達增加（P＜0.05），但左右兩側(cè)的p-NR1的含量無明顯差異；而來自＜CFA+FC>的結(jié)果顯示，當鞘內(nèi)給予FC后，相較＜CFA+Vehicle＞組該組雙側(cè)脊髓背角p-NR1表達水平均下調(diào)（P＜0.05）。
　　 這些結(jié)果表明：1）在CFA 誘導(dǎo)的外周炎癥痛覺過敏模型中，激活的膠質(zhì)細胞參與了痛覺過敏的發(fā)生；2）膠質(zhì)細胞可能通過釋放TNF-α，進而引起脊髓背角p-