MKP-1和磷酸化ERK蛋白在急性脊髓損傷大鼠模型中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景： 大量研究結(jié)果表明脊髓受外傷打擊時(shí)，受傷部位的中央灰質(zhì)神經(jīng)元與白質(zhì)區(qū)內(nèi)的傳導(dǎo)束并不足同步受損。白質(zhì)的損傷更多的是由于繼發(fā)損傷所致，因此，如果能將損傷限制在直接受傷部位，防止繼發(fā)損傷，白質(zhì)內(nèi)的傳導(dǎo)束就有可能被保留下來，脊髓損傷平面以下的肌肉就有可能有功能性支配，損傷灶周圍的灰質(zhì)神經(jīng)元也可以避免進(jìn)一步的喪失。而細(xì)胞凋亡是繼發(fā)性脊髓損傷的重要組成部分。繼發(fā)性脊髓損傷中出現(xiàn)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞死亡不是緣于真接損傷，而是繼發(fā)絀胞凋

2、亡的結(jié)果。 絲裂原激活貨白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑存在于真核細(xì)胞中是由四種激酶組成的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中，每種激酶都通過復(fù)雜的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)激活下游底物激酶，從而使細(xì)胞能夠在對(duì)各種胞外刺激作出反應(yīng)的同時(shí)仍能保持多樣性與特異性。MAPK通路是細(xì)胞增長(zhǎng)有關(guān)信號(hào)刺激脊椎類動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化或凋亡的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞的交匯點(diǎn)和共同通路，被廣泛用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究。它的級(jí)聯(lián)反

3、應(yīng)實(shí)際上是分三步進(jìn)行的：首先是MAPKK激酶(MAFKKkinase，MKKK)磷酸化激活MAFK激酶(MAPKkinase，MKK)，后者活化后磷酸化后并激活MAPK，活化的MAPK再去激活一些轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因表達(dá)。活化的MAPK主要被其磷酸酶去磷酸化而失活，這其中絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(mitogenactivatedproteinkinasephosphatase-1，MKP-1)的作用最為重要。其中，已知p38MAPK參與了

4、神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其表達(dá)的強(qiáng)弱預(yù)示神經(jīng)絀胞的存在與否，是細(xì)胞對(duì)不同損傷的應(yīng)急反應(yīng)表現(xiàn)。最新的研究表明，在脊髓損傷后神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡過程中可以看到p38MAPK表達(dá)的增加，說明脊髓損傷后存在p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變。不僅如此，已有另一篇報(bào)道認(rèn)為，興奮性毒性脊髓損傷可以引起損傷誘導(dǎo)的MKP-1→ELK－1→NF-kB信號(hào)級(jí)聯(lián)通路的活化以及在慢性疼痛過程發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用受體表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，而阻斷這個(gè)信號(hào)傳

5、導(dǎo)通路則可以防止損傷誘導(dǎo)疼痛表達(dá)的發(fā)生。 但是目前對(duì)MKP-1參與的MAPK信號(hào)通路在急性脊髓損傷后的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡過程中所起到的作用仍然不明，因此進(jìn)一步明確MKP－1蛋白在急性脊髓損傷后的活化與在細(xì)胞凋亡中的作用對(duì)于臨床上將損傷限制在直接受傷部位，防止繼發(fā)損傷，保留白質(zhì)內(nèi)的傳導(dǎo)束，避免損傷灶周剖的灰質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)一步的喪失具有重要意義。 目的： 探討絲裂原活化蛋白激酶(Mjtogenactivatedpro

6、teinkinase，MAPK)相關(guān)蛋白絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(mitogenactivatedproteinkinasephosphatase-1，MKP-1)利磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulatedkinases，ERK)在大鼠脊髓損傷后表達(dá)的變化及其意義。 方法： 20只SD大鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及假手術(shù)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組采用改良Allen’S打擊法制作脊髓損傷動(dòng)物模型，假

7、手術(shù)對(duì)照組同法暴露脊髓，但不損傷脊髓。2組大鼠術(shù)后12h取手術(shù)段脊髓，用蘇木精-伊紅染色觀察損傷脊髓組織病理變化；MKP-1和ERK蛋白免疫組織化學(xué)染色后，用UTHSCSAImageTools2.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定損傷處脊髓神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的單位而積內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞光密度值；用Westernblot測(cè)定并用灰度值表示MKP－1和P－ERK蚩白的表達(dá)量。 結(jié)果： 1、脊髓組織形態(tài)學(xué)改變：蘇木精－伊紅染色切片光鏡下

8、見假手術(shù)組脊髓組織結(jié)構(gòu)致密，細(xì)胞核圓而大、染色淺、核仁清晰。實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓組織有較多片狀出血及大量出血壞死后形成的囊腔，組織疏松水腫，神經(jīng)細(xì)胞腫脹較明顯，部分神經(jīng)元和膠質(zhì)絀胞幾乎溶解消失。 2、脊髓損傷處神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞MKP－1和P-ERK蛋白含量的變化：假手術(shù)組脊髓神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有MKP－1表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓組織有少量MKP-1的表達(dá)。P-ERK在實(shí)驗(yàn)組脊髓膠質(zhì)細(xì)胞可見有大量表達(dá)，而假手術(shù)組卻很少表達(dá)。用UTHS

9、CSAImageTools3.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定損傷處脊髓神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的單位而積內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞光密度值。 3、用Westernblot測(cè)定并用灰度值表示MKP－1和P-ERK蛋白的表達(dá)量，假手術(shù)對(duì)照組大鼠脊髓MKP－1的表達(dá)量明顯高于實(shí)驗(yàn)組大鼠，而同時(shí)P-ERK蛋白表達(dá)卻要低于實(shí)驗(yàn)組大鼠。(p＜0.01)。 結(jié)論： 1、本研究的結(jié)果初步證實(shí)在脊髓損傷早期，通過減少M(fèi)KP-1的表達(dá)和磷酸化ERK的增

10、加，一方面使得p38MAPK表達(dá)增加，神經(jīng)細(xì)胞凋亡；另外一個(gè)方面磷酸化ERK的結(jié)果，可以將脊髓損傷的信息轉(zhuǎn)化，促進(jìn)損傷后的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。 2、本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白MKP-1和ERK的研究不但有助于從分子水平揭示炎癥和免疫反應(yīng)機(jī)理，而且也為減少神經(jīng)變性，促進(jìn)神經(jīng)再生，提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和相應(yīng)的靶分子。 3、對(duì)于進(jìn)一步明確防止繼發(fā)損傷，保留白質(zhì)內(nèi)的傳導(dǎo)束，避免損傷灶周圍的灰質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)一步的喪失具有一定的意義