舒巴坦通過(guò)上調(diào)GLT-1的表達(dá)發(fā)揮抗大鼠缺血性腦損傷作用.pdf

1、谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)維持正常腦功能至關(guān)重要，但過(guò)高濃度的谷氨酸又具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性。大量研究表明，谷氨酸的興奮性毒性是腦缺血時(shí)神經(jīng)元損傷的重要機(jī)制。因此，降低腦缺血時(shí)細(xì)胞外液中谷氨酸的濃度，是減輕腦缺血時(shí)神經(jīng)元損傷的重要策略。
　　 腦內(nèi)細(xì)胞外沒(méi)有谷氨酸代謝酶，腦內(nèi)細(xì)胞外谷氨酸的穩(wěn)態(tài)主要依靠高親和力興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)（excitatoryaminoacidtransporters，EAATs）維持。

2、目前，已經(jīng)克隆出5種高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，包括EAAT1(GLAST)、EAAT2、EAAT3(EAACl)、EAAT4、EAAT5。EAAT2因主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上，又稱(chēng)為膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glialglutamatetransporter-1，GLT-1)。GLT-1在清除突觸間隙的谷氨酸、維持細(xì)胞外液谷氨酸濃度處于低水平、防止其興奮性毒性方面發(fā)揮重要作用。例如，短暫性全腦缺血可使海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)性死亡(

3、delayedneuronaldeath，DND)，同時(shí)引起GLT-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。在GLT-1基因敲除小鼠，其海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)退行性改變。我室研究發(fā)現(xiàn)，GLT-1表達(dá)上調(diào)在腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果提示，GLT-1的功能異常在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用，調(diào)制GLT-1的表達(dá)和功能、增強(qiáng)其攝取谷氨酸的能力，有可能成為腦缺血類(lèi)疾病預(yù)防和治療研究的新靶點(diǎn)。
　　 2005年Roth

4、stein等在Nature上報(bào)道，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，如頭孢曲松鈉可以增加GLT-1的表達(dá)和對(duì)谷氨酸的攝取。據(jù)此，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)預(yù)防性給予頭孢曲松鈉可通過(guò)上調(diào)GLT-1的表達(dá)減輕缺血性腦損傷。但是，直接將頭孢曲松鈉用于防治缺血性腦損傷面臨很多問(wèn)題，如大劑量長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的菌群失調(diào)、細(xì)菌耐藥等。因此，尋找既能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，又可以避免其副作用的替代品，對(duì)于上述研究成果的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化具有重要的意義。
　　 舒巴坦(sulbact

5、am)，為β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，屬于非典型β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物，具有β-內(nèi)酰胺環(huán)，與頭孢曲松鈉結(jié)構(gòu)相似，但其抗菌作用與頭孢曲松鈉相比非常弱，臨床上不單獨(dú)作為抗生素應(yīng)用，而是作為其它β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的增效劑?？紤]到舒巴坦與頭孢曲松鈉結(jié)構(gòu)上的相似性，舒巴坦有可能通過(guò)上調(diào)GLT-1的表達(dá)和功能而發(fā)揮與頭孢曲松鈉類(lèi)似的神經(jīng)元保護(hù)作用。更重要的是，因?yàn)槭姘吞箮缀鯚o(wú)抗菌作用，不會(huì)產(chǎn)生菌群失調(diào)等副作用，如能證明以上設(shè)想，將為應(yīng)用舒巴坦防治腦缺血性疾病的研

6、究開(kāi)辟新的領(lǐng)域，具有重要的臨床意義。綜上，本課題研究舒巴坦是否具有抗缺血性腦損傷作用、以及是否通過(guò)調(diào)制GLT-1發(fā)揮抗缺血性腦損傷作用。
　　 1、舒巴坦抗全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡
　　 應(yīng)用大鼠全腦缺血模型，觀察舒巴坦對(duì)全腦缺血引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND的影響，探討舒巴坦的抗缺血性腦損傷作用。
　　 方法:
　　 健康雄性Wistar大鼠(280-320g)，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)

7、驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將動(dòng)物隨機(jī)分為以下5組:
　　 (1)Sham組(n=5):行全腦缺血的sham手術(shù)。
　　 (2)舒巴坦對(duì)照組(n=5):首先給動(dòng)物注射舒巴坦，每日一次，共5次。于末次注射后1天行全腦缺血的sham手術(shù)。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組(生理鹽水(Normalsaline，NS)。
　　 (3)全腦缺血組(n=5):全腦缺血8min后恢復(fù)血液再灌流。
　　 (4)舒巴坦預(yù)防組(n=5):首先給動(dòng)物注射舒

8、巴坦，每日一次，共5次。于末次注射后1天行全腦缺血。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組(Normalsaline，NS)。根據(jù)舒巴坦的劑量進(jìn)一步分為20nmol，60nmol，180nmol3個(gè)亞組，以觀察其量效關(guān)系。
　　 (5)舒巴坦治療組(n=5):全腦缺血再灌注后即刻開(kāi)始給予舒巴坦，每天一次，共5次。根據(jù)舒巴坦的劑量進(jìn)一步分為20nmol，60nmol，180nmol3個(gè)亞組，以觀察其量效關(guān)系。同時(shí)設(shè)溶劑(Normalsaline，NS)

9、對(duì)照組。
　　 舒巴坦通過(guò)預(yù)先植入的套管行側(cè)腦室注射給藥。各組均于sham手術(shù)或腦缺血后7天取材，硫堇染色下進(jìn)行腦組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，對(duì)比分析組織學(xué)分級(jí)(histologicalgrading，HG)和神經(jīng)元濃密度（neuronaldensity,ND）的改變，觀察舒巴坦對(duì)全腦缺血再灌注所致大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND的影響
　　 結(jié)果:
　　 Sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊、致密，細(xì)胞形態(tài)完整，胞核

10、飽滿(mǎn)，核仁清晰，尼氏體豐富，無(wú)明顯的DND，HG為0～Ⅰ級(jí)，ND值為216±17.8mm-1。側(cè)腦室注射舒巴坦組和單純注射溶劑對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)組織細(xì)胞形態(tài)與sham組基本一致，表明側(cè)腦室置管及注射舒巴坦及其溶劑不會(huì)對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生損傷。8min全腦缺血組動(dòng)物出現(xiàn)了明顯的DND，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞稀疏，排列紊亂;殘存的錐體細(xì)胞體積縮小，呈三角形或不規(guī)則形;核仁消失;可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片，甚至表現(xiàn)為海馬CA1區(qū)大片神經(jīng)元缺失;與

11、Sham組相比，HG(Ⅱ～Ⅲ級(jí))明顯升高，ND值顯著降低（P＜0.05）。舒巴坦預(yù)防組中，20nmol劑量組海馬CA1區(qū)組織形態(tài)與全腦缺血組基本一致;60nmol組與全腦缺血組相比，神經(jīng)元數(shù)量有所增加，可見(jiàn)不完整的錐體細(xì)胞層;180nmol組神經(jīng)元存活狀態(tài)明顯改善，組織學(xué)特征與sham組類(lèi)似，神經(jīng)元排列比較整齊，細(xì)胞形態(tài)也比較完整，與全腦缺血組相比，HG明顯降低，ND值顯著升高(P＜0.05)。這些結(jié)果表明，隨著舒巴坦劑量的加大，其抗全

12、腦缺血打擊引起的海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞DND的作用越來(lái)越明顯，顯示出了較好的劑量依賴(lài)性。舒巴坦治療組中，小劑量亞組(20nmol和60nmol)均出現(xiàn)了明顯的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，與全腦缺血組相比HG和ND值均無(wú)明顯變化。與全腦缺血組相比，大劑量舒巴坦治療組(180nmol)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活狀態(tài)有所改善，有少量神經(jīng)元存活，但存活神經(jīng)元數(shù)量明顯少于預(yù)防組。預(yù)防性或者治療性給予舒巴坦的溶劑NS，均對(duì)全腦缺血引起的海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞DN

13、D無(wú)明顯影響。
　　 以上結(jié)果表明，腦缺血前預(yù)防性給予舒巴坦可有效地減輕全腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND，且呈現(xiàn)較好的劑量依賴(lài)性，大劑量組的保護(hù)作用更明顯;而腦缺血后給予舒巴坦對(duì)全腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的保護(hù)作不及預(yù)防性給藥。
　　 2、舒巴坦抑制全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)炎癥因子的表達(dá)
　　 觀察舒巴坦對(duì)大鼠在全腦缺血過(guò)程中，海馬CA1區(qū)產(chǎn)生的炎癥因子IL-1β和TNF-α的mRNA

14、表達(dá)和蛋白的濃度的影響，為證明舒巴坦發(fā)揮抗腦缺血作用提供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組同第一部分。各組動(dòng)物在sham手術(shù)或者缺血手術(shù)后0h，3h，6h，12h，1d，2d和3d時(shí)間點(diǎn)取海馬CA1區(qū)腦組織，分別應(yīng)用real-timePCR和ELISA方法觀察海馬CA1區(qū)組織勻漿中炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)和蛋白的濃度。
　　 結(jié)果:
　　 Real-timePCR

15、結(jié)果顯示，在sham組動(dòng)物海馬CA1區(qū)組織內(nèi)有IL-1β和TNF-α的mRNA基礎(chǔ)表達(dá)。單純注射舒巴坦對(duì)sham組動(dòng)物IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響。與sham組相比，腦缺血組動(dòng)物海馬中IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)在腦缺血后6h開(kāi)始明顯上調(diào)(P＜0.05)，并且這種上調(diào)一直持續(xù)到腦缺血后1d，隨后恢復(fù)到sham組水平。在舒巴坦預(yù)防組中，腦缺血前預(yù)防性給予舒巴坦明顯抑制了腦缺血引起的海馬CA1區(qū)IL-1β和TNF-

16、α的mRNA表達(dá)的上調(diào)，而且這種抑制作用表現(xiàn)出了良好的劑量依賴(lài)性，劑量越大，抑制作用越明顯(P＜0.05)。但是在舒巴坦治療組中，腦缺血后給予舒巴坦對(duì)腦缺血引起的海馬CA1區(qū)IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)的上調(diào)無(wú)明顯影響。同時(shí)，無(wú)論是預(yù)防性或者治療性給予舒巴坦的溶劑NS均對(duì)腦缺血造成的炎癥因子的mRNA濃度變化無(wú)明顯影響。
　　 ELISA結(jié)果顯示，在sham組動(dòng)物海馬CA1區(qū)組織內(nèi)有IL-1β和TNF-α蛋白的基礎(chǔ)生成。

17、舒巴坦對(duì)照組和溶劑對(duì)照組IL-1β和TNF-α蛋白的濃度與Sham組類(lèi)似。與sham組相比，腦缺血組動(dòng)物的IL-1β和TNF-α蛋白濃度于腦缺血后1d時(shí)開(kāi)始顯著上調(diào)，并一直維持到腦缺血后2d(P＜0.05)，隨之回落至sham組水平。預(yù)防性給予舒巴坦后，明顯抑制了腦缺血引起的IL-1β和TNF-α蛋白生成的上調(diào)，表現(xiàn)為其上升的高峰顯著降低（P＜0.05）。并且，這種抑制作用表現(xiàn)出了良好的劑量依賴(lài)性，大劑量組(180nmol)的抑制作用最

18、為明顯。然而，治療性給予舒巴坦在各個(gè)劑量組均未發(fā)現(xiàn)其對(duì)腦缺血引起的IL-1β和TNF-α蛋白生成的上調(diào)有明顯的抑制作用。同時(shí)，無(wú)論是預(yù)防性或者治療性給予舒巴坦的溶劑NS均對(duì)腦缺血引起的IL-1β和TNF-α的蛋白生成無(wú)明顯影響。
　　 以上結(jié)果提示，舒巴坦下調(diào)腦缺血過(guò)程中炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，進(jìn)一步表明舒巴坦的抗腦缺血作用。
　　 3、舒巴坦上調(diào)全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的表達(dá)
　　 觀察

19、舒巴坦對(duì)全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的表達(dá)，為證明舒巴坦通過(guò)上調(diào)GLT-1的表達(dá)和功能發(fā)揮抗缺血性腦損傷的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組同第一部分(1)-(4)組。
　　 考慮到預(yù)防性應(yīng)用舒巴坦與治療性應(yīng)用舒巴坦發(fā)揮作用的機(jī)制可能是一致的，因此，本部分只進(jìn)行預(yù)防性應(yīng)用舒巴坦的機(jī)制研究。
　　 各組動(dòng)物在sham手術(shù)或者腦缺血后于0h，6h，12h，1d，2d和3d時(shí)間點(diǎn)取材，

20、分別應(yīng)用quantitative(realtime)RT-PCR和Semi-quantitativeRT-PCR觀察GLT-1mRNA表達(dá);于sham手術(shù)或者腦缺血后0h，12h，1d，3d，5d，7d取材，分別應(yīng)用Westernblot和免疫組織化學(xué)方法觀察GLT-1蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 半定量RT-PCR結(jié)果顯示，與sham組相比舒巴坦對(duì)照組（sulbactam+sham組）動(dòng)物GLT-1的mRNA所有時(shí)

21、間點(diǎn)的表達(dá)都明顯升高(P＜0.05)。與sham組相比，腦缺血組的GLT-1mRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.05)，該下調(diào)是從腦缺血后2d開(kāi)始，持續(xù)到3d。在腦缺血基礎(chǔ)上預(yù)防性給予舒巴坦，在1d時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始顯示GLT-1mRNA表達(dá)的顯著上調(diào)，且逆轉(zhuǎn)了全腦缺血導(dǎo)致的GLT-1mRNA表達(dá)的下調(diào)（P＜0.05），大劑量(180nmol)組GLT-1mRNA表達(dá)的上調(diào)尤為明顯。側(cè)腦室注射舒巴坦的溶劑對(duì)GLT-1的mRNA表達(dá)無(wú)明顯作用。Real

22、-timeRT-PCR結(jié)果與半定量RT-PCR顯示結(jié)果一致。
　　 Westernblotanalysis結(jié)果顯示，與sham組相比，舒巴坦對(duì)照組（sulbactam+sham組）中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的GLT-1的蛋白表達(dá)均顯著升高(P＜0.05)。全腦缺血組的GLT-1的蛋白表達(dá)從全腦缺血后3d起顯著降低，一直持續(xù)至7d（P＜0.05）。大劑量舒巴坦(180nmol)，可明顯上調(diào)全腦缺血大鼠GLT-1蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)全腦缺血導(dǎo)致的GL

23、T-1的蛋白表達(dá)的下調(diào);而低劑量舒巴坦對(duì)全腦缺血大鼠GLT-1蛋白表達(dá)下調(diào)無(wú)明顯影響。同時(shí)，無(wú)論在sham基礎(chǔ)上還是在腦缺血基礎(chǔ)上，側(cè)腦室注射舒巴坦的溶劑對(duì)GLT-1的蛋白表達(dá)均無(wú)明顯作用。
　　 免疫組化結(jié)果顯示，sham組大鼠海馬CA1區(qū)可見(jiàn)到一定量GLT-1陽(yáng)性免疫顆粒，呈棕黃色，染色較淺，均勻分布，錐體神經(jīng)元細(xì)胞之間未見(jiàn)明顯GLT-1的陽(yáng)性顆粒。舒巴坦對(duì)照組大鼠可見(jiàn)大量GLT-1陽(yáng)性標(biāo)記物廣泛分布于海馬CA1區(qū)，尤其在海

24、馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層，與sham組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，其積分光密度顯著升高（P＜0.05）。與sham組相比，腦缺血組大鼠海馬CA1的GLT-1陽(yáng)性免疫顆粒顯著減少(P＜0.05)，甚至在錐體細(xì)胞層及其周?chē)霈F(xiàn)大片GLT-1表達(dá)缺失區(qū)域。與腦缺血組相比，低劑量舒巴坦(20nmol，60nmol)對(duì)全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的免疫陽(yáng)性染色強(qiáng)度均無(wú)明顯變化，而舒巴坦大劑量(180nmol)組大鼠可見(jiàn)大量棕褐色GLT-1陽(yáng)性免疫顆粒分布

25、于海馬CA1區(qū)，尤其在海馬錐體細(xì)胞層可見(jiàn)大量、深染的GLT-1陽(yáng)性顆粒包繞錐體神經(jīng)元細(xì)胞。與全腦缺血組相比，側(cè)腦室給予舒巴坦溶劑對(duì)GLT-1的陽(yáng)性表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　 以上結(jié)果提示，舒巴坦可引起GLT-1表達(dá)的上調(diào)，舒巴坦上調(diào)GLT-1的表達(dá)可能是其抗缺血性腦損傷的機(jī)制之一。
　　 4、抑制GLT-1的表達(dá)和功能阻斷舒巴坦抗大鼠缺血性腦損傷作用
　　 觀察應(yīng)用GLT-1AS-ODNs或GLT-1的特異性阻斷劑二

26、氫卡因酸鹽(dihydrokainateDHK)，阻斷GLT-1的表達(dá)和功能，對(duì)舒巴坦抗海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND作用的影響，為闡明舒巴坦通過(guò)上調(diào)GLT-1的表達(dá)和功能發(fā)揮抗缺血性腦損傷作用提供進(jìn)一步的的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 在上述第一部分(1)-(4)的基礎(chǔ)上，另設(shè)計(jì)以下4組:
　　 (5)AS-ODNs+舒巴坦預(yù)防組:于全腦缺血前2天開(kāi)始側(cè)腦室注射GLT-1AS-ODNs(18nmol/10μl)

27、，每天1次，共4次，最后一次注射在全腦缺血再灌后1d。其余操作同舒巴坦預(yù)防組。同時(shí)設(shè)AS-ODNs溶劑對(duì)照組。
　　 (6)AS-ODNs對(duì)照組:在sham組大鼠基礎(chǔ)上，側(cè)腦室注射GLT-1AS-ODNs(18nmol/10μl)，注射程序與AS-ODNs+舒巴坦預(yù)防組相同。其余同sham組。
　　 (7)DHK+舒巴坦預(yù)防組:于全腦缺血前30min側(cè)腦室注射DHK(200nmol)。其余步驟同舒巴坦預(yù)防組。同時(shí)設(shè)DHK

28、溶劑對(duì)照組。
　　 (8)DHK對(duì)照組:在sham組大鼠基礎(chǔ)上側(cè)腦室注射DHK(200nmol)，注射程序與DHK+舒巴坦預(yù)防組相同。其余同sham組。
　　 上述(1)-(6)組動(dòng)物在sham手術(shù)或者腦缺血手術(shù)后3d和7d取材，通過(guò)Westernblot方法觀察GLT-1的蛋白表達(dá)變化，驗(yàn)證GLT-1AS-ODNs對(duì)GLT-1蛋白表達(dá)的抑制作用。所有動(dòng)物在sham手術(shù)或者腦缺血手術(shù)后7d取材，硫堇染色下進(jìn)行腦組織病理學(xué)

29、評(píng)價(jià)，觀察GLT-1AS-ODNs和DHK對(duì)舒巴坦抗全腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND作用的影響。
　　 結(jié)果:
　　 Westernblot結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射GLT-1AS-ODNs抑制了大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1的蛋白表達(dá)。與全腦缺血組相比，預(yù)防性給與舒巴坦(180nmol)可以顯著上調(diào)GLT-1的蛋白表達(dá)，且翻轉(zhuǎn)了腦缺血引起的GLT-1的蛋白表達(dá)的下調(diào)（P＜0.05）。當(dāng)在舒巴坦預(yù)防組側(cè)腦室注射了GL

30、T-1As-ODNs后，舒巴坦引起的GLT-1的蛋白表達(dá)上調(diào)被顯著抑制(P＜0.05)，其GLT-1蛋白表達(dá)水平下降到了腦缺血組水平。而AS-ODNs溶劑則對(duì)舒巴坦引起的GLT-1的蛋白表達(dá)上調(diào)無(wú)顯著影響。
　　 腦組織病理學(xué)評(píng)價(jià)顯示，sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列整齊、致密，共2-3層，細(xì)胞形態(tài)完整、邊界清晰、尼氏小體豐富，胞核大而圓、核仁清晰。組織學(xué)分級(jí)(HG)為0級(jí)，神經(jīng)元密度(ND)高。在舒巴坦對(duì)照組和GLT-

31、1AS-ODNs對(duì)照組沒(méi)有觀察到明顯的神經(jīng)元損傷，細(xì)胞形態(tài)與sham組基本一致，表明側(cè)腦室置管及注射舒巴坦、GLT-1AS-ODNs不會(huì)對(duì)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生損傷。而全腦缺血組觀察到大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的DND，表現(xiàn)為幾乎全部神經(jīng)元死亡，殘存的神經(jīng)元胞體皺縮，呈多角形或梭形，胞核固縮、濃染，核仁不清或消失;可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片，甚至表現(xiàn)為海馬CA1區(qū)大片神經(jīng)元缺失，與sham組相比，HG（Ⅱ～Ⅲ級(jí)）明顯升高，ND值顯著降低（

32、P＜0.05）。舒巴坦預(yù)防組神經(jīng)元排列依然比較整齊，細(xì)胞形態(tài)也比較完整，數(shù)量也無(wú)明顯下降。提示大劑量舒巴坦對(duì)抗了全腦缺血引起的海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞DND的作用。而應(yīng)用GLT-1反義寡核苷酸后與舒巴坦預(yù)防組相比，出現(xiàn)了明顯的DND，神經(jīng)元大片或幾乎全部死亡;而AS-ODNs溶劑對(duì)照組組則沒(méi)有上述作用。表明GLT-1AS-ODNs抑制了舒巴坦對(duì)全腦缺血引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，使其喪失了對(duì)抗損傷性腦缺血引起的DND的能力。

33、
　　 應(yīng)用DHK抑制GLT-1的功能后，同樣可阻斷舒巴坦對(duì)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的保護(hù)作用，表現(xiàn)為與舒巴坦預(yù)防組相比，在舒巴坦預(yù)防組應(yīng)用DHK后出現(xiàn)了明顯的DND，神經(jīng)元大片或幾乎全部死亡;而DHK溶劑對(duì)照組則沒(méi)有上述作用。
　　 以上結(jié)果表明，應(yīng)用GLT-1AS-ODNs或DHK抑制GLT-1的表達(dá)和功能，顯著抑制了舒巴坦抗全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND的作用，表明舒巴坦通過(guò)上調(diào)GLT-1的表達(dá)發(fā)揮抗缺血性

34、腦損傷作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、舒巴坦抑制了全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND、和炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)，表明舒巴坦具有保護(hù)神經(jīng)元、提高其抗缺血性損傷作用。
　　 2、舒巴坦上調(diào)了全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 3、GLT-1AS-ODNs和GLT-1的特異性抑制劑DHK抑制了舒巴坦抗全腦缺血引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND的作用。