舒巴坦通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞p38 MAPK通路上調(diào)GLT-1的表達(dá)發(fā)揮抗氧葡萄糖剝奪引起的海馬神經(jīng)元死亡的作用.pdf

1、谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)維持正常腦功能至關(guān)重要，但突觸間隙過高濃度的谷氨酸同時(shí)具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性。腦缺血和再灌注后，谷氨酸的過度釋放或谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)谷氨酸清除不足可導(dǎo)致谷氨酸在突觸間隙中堆積，突觸間隙過量的谷氨酸作用于神經(jīng)元突觸后膜的離子型和代謝型谷氨酸受體，可引發(fā)興奮性毒性，例如鈣超載，鈉超載，自由基產(chǎn)生和凋亡等。腦內(nèi)細(xì)胞外沒有代謝谷氨酸的酶，腦內(nèi)細(xì)胞外谷氨酸的清除主要依靠高親和力興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)(ex

2、citatory amino acid transporters，EAATs)來維持。膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glial glutamate transporter-1，GLT-1)在清除細(xì)胞外谷氨酸中的作用最為重要。多種證據(jù)表明，腦缺血預(yù)處理或藥物可以通過上調(diào) GLT-1的表達(dá)及增強(qiáng)GLT-1對(duì)谷氨酸的攝取活性，對(duì)神經(jīng)元的缺血損傷發(fā)揮保護(hù)作用。
　　Rothstein等報(bào)道，在體實(shí)驗(yàn)中，β-內(nèi)酰胺抗生素如頭孢曲松可選擇性地促進(jìn)

3、GLT-1在腦內(nèi)的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)中，頭孢曲松可顯著激活人胎兒星形膠質(zhì)細(xì)胞或COS7細(xì)胞系中的GLT-1啟動(dòng)子，進(jìn)而促進(jìn)GLT-1的上調(diào)。但大量使用β-內(nèi)酰胺抗生素，會(huì)帶來例如菌群失調(diào)和細(xì)菌耐藥性等多種副作用。舒巴坦是一種非典型的β-內(nèi)酰胺抗生素，抗菌能力很弱，臨床上常作為其它β-內(nèi)酰胺類抗生素的增效劑。我室最近的研究表明，在大鼠全腦缺血模型中，舒巴坦預(yù)防性給藥，可以通過上調(diào)海馬CA1區(qū)GLT-1的表達(dá)減輕錐體神經(jīng)元的缺血性損傷。這些發(fā)現(xiàn)

4、為應(yīng)用舒巴斯坦預(yù)防和治療腦缺血損傷的臨床研究提供了有益的基礎(chǔ)和參考。然而，在體實(shí)驗(yàn)很難證明舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的直接作用，因此有必要利用星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，體外研究舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的直接作用。此外，進(jìn)一步研究舒巴坦上調(diào)GLT-1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可更好地理解舒巴坦在腦內(nèi)的作用，促進(jìn)舒巴坦作為抗腦缺血藥物的臨床開發(fā)和應(yīng)用研究。
　　p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated

5、proteinkinases，p38 MAPK)是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，參與一系列生理和病理過程，包括細(xì)胞死亡和存活。p38 MAPK的激活如一把雙刃劍，p38 MAPK的過度激活可促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)元死亡，但也有充分證據(jù)表明p38 MAPK的適度激活對(duì)缺血組織器官的保護(hù)作用。我室最新研究表明，全腦缺血預(yù)處理可誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)p38 MAPK適度激活，同時(shí)p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580或反義寡核苷酸可抑制全腦

6、缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受和海馬CA1區(qū)GLT-1上調(diào)。這些研究結(jié)果表明，p38 MAPK的適度激活可能介導(dǎo)GLT-1表達(dá)的上調(diào)，并誘導(dǎo)腦缺血耐受。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究 p38 MAPK信號(hào)通路在舒巴坦誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)上調(diào)和抗氧葡萄糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）模擬缺血損傷過程中的作用。
　　第一部分：舒巴坦發(fā)揮抗氧葡萄糖剝奪引起的海馬神經(jīng)元死亡和上調(diào)海馬

7、星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的作用
　　目的：
　　應(yīng)用神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)，觀察舒巴坦對(duì)OGD引起的海馬神經(jīng)元死亡的影響，探討舒巴坦的抗OGD引起的神經(jīng)元損傷作用。應(yīng)用單純星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通過觀察在OGD狀態(tài)下，舒巴坦預(yù)孵育對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的影響，證明星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)上調(diào)在舒巴坦抗OGD中的作用。
　　方法：
　　為觀察舒巴坦對(duì)OGD引起的海馬神經(jīng)元死亡的影響，取24 h內(nèi)新生

8、鼠海馬行神經(jīng)元星型膠質(zhì)共培養(yǎng)10天后，細(xì)胞隨機(jī)分為4組；為觀察舒巴坦預(yù)孵育對(duì)OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的影響，取1-2天新生鼠海馬行單純星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，并將細(xì)胞傳至3-4代，最后一代細(xì)胞長滿瓶底后，將細(xì)胞隨機(jī)分為3組（4組中的前3組），4組如下：
　　(1)對(duì)照組：正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h+2 h+24 h，以上時(shí)間段分別對(duì)應(yīng)下面實(shí)驗(yàn)分組中實(shí)驗(yàn)處理的時(shí)間段，48 h對(duì)應(yīng)舒巴坦孵育的時(shí)間段，2 h對(duì)應(yīng)OGD的時(shí)間段，24

9、 h對(duì)應(yīng)OGD復(fù)氧后至收集細(xì)胞的時(shí)間段。
　　(2)OGD組：首先細(xì)胞正常培養(yǎng)48 h后（對(duì)應(yīng)下一組舒巴坦孵育時(shí)間段），進(jìn)行2 h的OGD后，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。
　　(3)舒巴坦+OGD組：共培養(yǎng)細(xì)胞用加入舒巴坦培養(yǎng)液中孵育48 h，之后行OGD，方法同OGD組。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組，用NS代替舒巴坦。根據(jù)舒巴坦的劑量，進(jìn)一步分為5μM,25μM和125μM3個(gè)亞組，以觀察其量效關(guān)系。
　　(4)舒巴坦對(duì)照

10、組：這一實(shí)驗(yàn)組只用于共培養(yǎng)中，觀察細(xì)胞存活情況。培養(yǎng)基中加入舒巴坦生理鹽溶液（100×），在舒巴坦終濃度為125μM下孵育48小時(shí)，換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h+24 h。
　　共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)各組于OGD復(fù)氧后24 h或相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，赫克斯特/碘化丙啶(hoechst/propidium iodide, HO/PI)染色法觀察計(jì)數(shù)神經(jīng)元死亡百分率，MTT法觀察細(xì)胞活力，分析舒巴坦對(duì)OGD所致的海馬神經(jīng)元死亡及損傷的影響。單純星

11、形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)各組于OGD復(fù)氧后12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)或相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集星形膠質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot兩種方法觀察舒巴坦對(duì)OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.HO/PI染色顯示，對(duì)照組死亡細(xì)胞百分比是9.2±0.5％。2 h OGD可以使死亡細(xì)胞的百分比增加到71.6±2.4%，與對(duì)照組相比，死亡細(xì)胞的百分比明顯提高；而且明場照片與 HO/PI染色熒光圖片合成后

12、可以看出，死亡細(xì)胞主要為神經(jīng)元，說明2 h的OGD可以使神經(jīng)元的死亡百分率明顯提高。舒巴坦預(yù)孵育可以劑量依賴地降低海馬神經(jīng)元的死亡率，125μM的舒巴坦具有最好的藥效，125μM的舒巴坦預(yù)孵育可以將死亡細(xì)胞的百分比降低至15.6±1.0%。NS溶劑對(duì)照組與OGD組相比，死亡細(xì)胞的百分比無明顯差異，說明溶劑不能改變OGD引起的海馬神經(jīng)元死亡。以上結(jié)果共同說明，2 h的OGD可以明顯增加神經(jīng)元的死亡，而舒巴坦有效的阻止了OGD引起的海馬神經(jīng)

13、元死亡，此效應(yīng)呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。與對(duì)照組相比，舒坦坦對(duì)照組中，正常共培養(yǎng)中加入最大濃度125μM的舒巴坦并未引起死亡細(xì)胞的百分比的改變，說明最大濃度125μM的舒巴坦無明顯損傷作用。
　　2.MTT檢測結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，2 h的OGD可顯著降低共培養(yǎng)的細(xì)胞活力；而48 h的舒巴坦預(yù)孵育可以劑量依賴地增加共培養(yǎng)的細(xì)胞活力，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。舒巴坦對(duì)照組的細(xì)胞活力與正常對(duì)照組相比無明顯差異，說明最大濃度125μM的

14、舒巴坦無明顯損傷作用。
　　以上結(jié)果表明，舒巴坦可劑量依賴的對(duì)抗氧葡萄糖剝奪引起海馬神經(jīng)元死亡和損傷。
　　3.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：在對(duì)照組，GLT-1廣泛表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。與對(duì)照組相比，OGD組的GLT-1表達(dá)明顯下調(diào)，約為正常組的1/2-2/3。與OGD組相比，舒巴坦預(yù)孵育可以顯著上調(diào)OGD處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)，這種上調(diào)呈明顯的劑量依賴性，最大劑量125μM舒巴坦可使其表達(dá)增加至對(duì)照組的1.5-2倍，

15、OGD組的2-3倍，并且這種上調(diào)可持續(xù)到OGD后24 h，這一時(shí)間覆蓋了OGD后神經(jīng)元死亡的時(shí)間，有利于其發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。與OGD組相比，舒巴坦的溶劑對(duì)照組GLT-1的表達(dá)無明顯變化。
　　4.Western blot結(jié)果顯示：對(duì)照組GLT-1有一定的基礎(chǔ)表達(dá)。與對(duì)照組相比，OGD組的GLT-1表達(dá)明顯下調(diào)。與OGD組相比，舒巴坦+OGD組 GLT-1的表達(dá)明顯上調(diào)，呈劑量依賴性，且表達(dá)上調(diào)時(shí)間可持續(xù)到到OGD復(fù)氧后24 h。

16、與OGD組相比，舒巴坦的溶劑對(duì)照組GLT-1的表達(dá)無明顯變化。
　　小結(jié)：
　　舒巴坦可劑量依賴的引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1表達(dá)的持續(xù)上調(diào)，這種上調(diào)可能是共培養(yǎng)中舒巴坦對(duì)抗OGD引起神經(jīng)元死亡的機(jī)制之一。
　　第二部分 舒巴坦序列上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38 MAPK和GLT-1的表達(dá)
　　目的：
　　1.觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞 GLT-1、p-p38 MAPK和總 p38 MAPK表達(dá)的影響。

17、>　　2.比較舒巴坦上調(diào)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。
　　方法：
　　行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，純化并傳至3-4代，最后1代細(xì)胞布滿瓶底時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。
　　1.為觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的劑量依賴性，用終濃度為5μM，25μM和125μM的舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞，于孵育48 h后收集細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot法觀察不同劑量的舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞

18、GLT-1表達(dá)的影響。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組，培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑NS。
　　2.為觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程，用終濃度為125μM舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞，于舒巴坦孵育1 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h和72 h時(shí)收集細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot法觀察舒巴坦的不同孵育時(shí)間對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞 GLT-1表達(dá)的影響。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組，培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑NS。

19、　　3.為觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞 p-p38 MAPK表達(dá)的劑量依賴性，用終濃度為5μM，25μM和125μM的舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞，于孵育48 h后收集細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot法觀察不同劑量的舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38 MAPK表達(dá)的影響；于孵育24 h后收集細(xì)胞，觀察不同劑量的舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞總p38 MAPK表達(dá)的影響。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組，培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑NS。
　　4.觀察

20、舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38 MAPK表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程，用終濃度為125μM舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞，于舒巴坦孵育1 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h和72 h時(shí)收集細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot法觀察舒巴坦的不同孵育時(shí)間對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38 MAPK和總p38 MAPK表達(dá)的影響。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組，培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑NS。
　　結(jié)果：
　　1.在觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞

21、 GLT-1表達(dá)的劑量依賴性實(shí)驗(yàn)中，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：在溶劑對(duì)照組，GLT-1廣泛表達(dá)于培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞。應(yīng)用舒巴坦孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞48 h，與對(duì)照組相比，5μM，25μM和125μM的舒巴坦顯著增加GLT-1的表達(dá)，這種上調(diào)呈劑量依賴性。Western blot分析顯示與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相同。
　　2.在觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)中，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：在125μM的舒巴坦孵育后，與溶劑對(duì)照

22、組相比， GLT-1的表達(dá)從舒巴坦孵育12 h開始增加，48 h達(dá)到高峰，72 h仍維持在與較高水平。Western blot分析顯示與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相同。
　　3.在觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38 MAPK表達(dá)的劑量依賴性實(shí)驗(yàn)中，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，在溶劑對(duì)照組，p-p38 MAPK主要表達(dá)于培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核，細(xì)胞漿也有少量表達(dá)，主要存在于細(xì)胞核周圍，且染色較淺，表達(dá)量較少；p38主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞

23、漿，并有大量表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot法檢測均顯示：應(yīng)用舒巴坦孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞3 h，與對(duì)照組相比，5μM，25μM和125μM的舒巴坦均顯著增加p-p38 MAPK的表達(dá)，且這種上調(diào)呈劑量依賴性。在舒巴坦組，應(yīng)用5μM，25μM和125μM舒巴坦孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，p38的表達(dá)與溶劑對(duì)照組相比無明顯差異。Western blot分析顯示與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相同。
　　4.在觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞GL

24、T-1表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)中，免疫細(xì)胞化學(xué)和 Western blot法檢測結(jié)果均顯示，在溶劑對(duì)照組，p-p38 MAPK有少量的表達(dá)；在舒巴坦組，應(yīng)用125μM的舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞，與溶劑對(duì)照組相比，p-p38 MAPK的表達(dá)從舒巴坦孵育1 h開始增加，3 h達(dá)到高峰，24 h恢復(fù)到對(duì)照基礎(chǔ)水平。在舒巴坦組，應(yīng)用125μM的舒巴坦孵育正常星形膠質(zhì)細(xì)胞，總p38 MAPK的表達(dá)在任何時(shí)間點(diǎn)與溶劑對(duì)照組相比均無顯著性差異。

25、　　小結(jié)：
　　1.舒巴坦可上調(diào)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1表達(dá)，這種上調(diào)具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性，舒巴坦孵育12 h開始增加，48 h達(dá)到高峰，72 h仍維持在與較高水平。
　　2.舒巴坦可上調(diào)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的p-p38 MAPK表達(dá)，這種上調(diào)具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性，且舒巴坦對(duì)總p38 MAPK的表達(dá)無影響， p-p38 MAPK的上調(diào)為p38 MAPK的磷酸化激活所致。p-p38 MAPK的上調(diào)從舒巴坦孵育1h開

26、始增加，3h達(dá)到高峰，24h恢復(fù)到對(duì)照基礎(chǔ)水平。
　　第三部分：抑制p38 MAPK通路阻斷舒巴坦引起的正常和OGD-處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)
　　目的：
　　應(yīng)用單純星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察 p-p38 MAPK抑制劑SB203580對(duì)正常和OGD-處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中舒巴坦誘導(dǎo)的GLT-1上調(diào)的影響，探討p-p38 MAPK通路是否參與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中舒巴坦誘導(dǎo)的GLT-1的上調(diào)。
　　方法：<

27、br>　　1.行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，純化并傳至3-4代，最后1代細(xì)胞布滿瓶底時(shí)用于實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞隨機(jī)分為以下4組：
　　(1)對(duì)照組：正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞在正常的培養(yǎng)基中孵育1 h+48 h，相當(dāng)于SB203580與舒巴坦的共同孵育時(shí)間。
　　(2)舒巴坦組：在正常的培養(yǎng)基中孵育1 h后，換成終濃度為125μM舒巴坦的培養(yǎng)液中孵育48 h。
　　(3)SB203580+舒巴坦組：首先正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入SB2035

28、80孵育1 h，再加入終濃度為125μM的舒巴坦與SB203580共同孵育48 h，根據(jù)SB203580的不同劑量分為2.5μM,5μM和10μM三個(gè)亞組。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組，用DMSO代替SB203580。
　　(4)SB203580對(duì)照組：用終濃度為10μM的SB203580孵育正常星形膠質(zhì)細(xì)胞1 h+48 h。
　　收集以上各組的星形膠質(zhì)細(xì)胞后，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和 western blot兩種方法觀察各組GLT-1的表達(dá)

29、，分析抑制p-p38 MAPK通路對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中舒巴坦誘導(dǎo)的GLT-1上調(diào)的影響。
　　2.行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，純化并傳至3-4代，最后1代細(xì)胞布滿瓶底時(shí)用于實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞隨機(jī)分為以下4組：
　　(1)對(duì)照組：正常星形膠質(zhì)細(xì)胞在正常的培養(yǎng)基中孵育1 h+48 h+2 h，(相當(dāng)于SB203580先單獨(dú)孵育1 h、舒巴坦和SB203580共同孵育時(shí)間48 h和OGD的時(shí)間2 h)，換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h收

30、集細(xì)胞。
　　(2)OGD組：首先星形膠質(zhì)細(xì)胞正常培養(yǎng)1 h+48 h后，進(jìn)行2 h的OGD后，換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h收集細(xì)胞。
　　(3)舒巴坦+OGD組：星形膠質(zhì)細(xì)胞在正常的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h，加入終濃度為125μM舒巴坦培養(yǎng)液中孵育48 h，其余步驟同OGD組。
　　(4)SB203580+舒巴坦+OGD組：正常星形膠質(zhì)細(xì)胞首先在終濃度為2.5μM，5μM和10μM的SB203580的培養(yǎng)基中孵

31、育1 h，再加入舒巴坦使其終濃度為125μM，并與SB203580共同孵育48 h，其余步驟同OGD組，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組，用DMSO代替SB203580。
　　實(shí)驗(yàn)各組于OGD復(fù)氧后12 h或24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)及對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot法，觀察各組GLT-1的表達(dá)，分析抑制p-p38 MAPK通路對(duì)舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)OGD處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1上調(diào)的影響。
　　結(jié)果：

32、>　　1.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，在對(duì)照組，GLT-1廣泛表達(dá)于培養(yǎng)的單純星形膠質(zhì)細(xì)胞。與對(duì)照組相比，舒巴坦組應(yīng)用125μM舒巴坦孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后，GLT-1的表達(dá)顯著上調(diào)。與舒巴坦組相比，SB203580+舒巴坦組中應(yīng)用2.5μM,5μM,10μM的SB203580孵育，GLT-1的表達(dá)明顯下調(diào)，且這種下調(diào)呈顯著的劑量依賴性。溶劑對(duì)照組，與舒巴坦組相比GLT-1的表達(dá)無明顯改變。與對(duì)照組相比，SB203580對(duì)照組中，用10μM的SB

33、203580孵育正常星形膠質(zhì)細(xì)胞，GLT-1的基礎(chǔ)表達(dá)無明顯改變。
　　2.Western blot的結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果一致。與對(duì)照組相比，舒巴坦組的GLT-1表達(dá)顯著上調(diào)。與舒巴坦組相比，SB203580+舒巴坦組的GLT-1表達(dá)劑量依賴性的顯著下調(diào)。在 SB203580的溶劑對(duì)照組， SB203580的溶劑對(duì)舒巴坦誘導(dǎo)的GLT-1上調(diào)無影響。在SB203580對(duì)照組中，10μM的SB203580對(duì)基礎(chǔ)表達(dá)的GLT-1無明顯

34、影響。Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果共同說明，SB203580劑量依賴的抑制舒巴坦誘導(dǎo)的正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1的上調(diào)。
　　3.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：在對(duì)照組，GLT-1廣泛表達(dá)于培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞。與對(duì)照組相比，OGD組的GLT-1表達(dá)明顯下調(diào)，約為正常對(duì)照組的1/2-2/3。在舒巴坦+OGD組，與OGD組相比，125μM的舒巴坦預(yù)孵育48 h后，可以顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1表達(dá)，其表達(dá)是正常水平的1

35、.5-2倍。在SB203580+舒巴坦+OGD組，與舒巴坦+OGD組相比，2.5μM，5μM和10μM的SB203580可以顯著抑制舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞 GLT-1的上調(diào)，這種抑制作用呈劑量依賴性，10μM的SB203580表現(xiàn)出最好的抑制效果。單獨(dú)加入SB203580的溶劑對(duì)舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的上調(diào)無影響。
　　4.Western blot法檢測結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相一致，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比

36、，OGD組的GLT-1表達(dá)明顯下調(diào)。在舒巴坦+OGD組，與OGD組相比，舒巴坦可以顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)；與舒巴坦+OGD組相比，SB203580+舒巴坦+OGD組的GLT-1的表達(dá)上調(diào)被顯著抑制，這種抑制呈劑量依賴性。SB203580的溶劑對(duì)舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的GLT-1上調(diào)無影響。Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果共同說明，SB203580可劑量依賴的抑制舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的上調(diào)。

37、　　小結(jié)：
　　1.抑制 p38 MAPK通路阻斷了舒巴坦誘導(dǎo)的正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1的上調(diào)，p38 MAPK通路參與了正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中舒巴坦誘導(dǎo)的GLT-1的上調(diào)。
　　2.抑制p38 MAPK通路阻斷舒巴坦引起的OGD處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)，p38 MAPK通路參與了舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)上調(diào)。
　　第四部分 抑制p38 MAPK通路阻斷舒巴坦介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元抗

38、OGD作用
　　目的：
　　應(yīng)用神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)，觀察p38 MAPK抑制劑SB203580對(duì)舒巴坦抗海馬神經(jīng)元OGD作用的影響，探討p38 MAPK通路是否參與舒巴坦誘導(dǎo)的抗OGD損傷的神經(jīng)元保護(hù)作用。
　　方法：
　　取24 h內(nèi)新生鼠進(jìn)行海馬神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)10天后，將細(xì)胞隨機(jī)分為以下6組：
　　(1)對(duì)照組：正常培養(yǎng)基培養(yǎng)海馬神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞1 h+48 h+2 h+24 h，

39、以上時(shí)間段分別對(duì)應(yīng)下面實(shí)驗(yàn)分組中實(shí)驗(yàn)處理的時(shí)間段，1 h+48 h對(duì)應(yīng)SB203580孵育時(shí)間段，48 h對(duì)應(yīng)舒巴坦孵育的時(shí)間段，2 h對(duì)應(yīng)OGD的時(shí)間段，24 h對(duì)應(yīng)OGD復(fù)氧后至收集細(xì)胞的時(shí)間段。
　　(2)OGD組：首先共培養(yǎng)細(xì)胞正常培養(yǎng)1+48 h后（對(duì)應(yīng)SB203580孵育時(shí)間段），進(jìn)行2 h氧葡萄糖剝奪后換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。
　　(3)舒巴坦+OGD組：共培養(yǎng)細(xì)胞先正常培養(yǎng)1 h，加入舒巴坦培養(yǎng)液中孵

40、育48 h，之后行OGD，方法同OGD組。
　　(4)SB203580+舒巴坦+OGD組：在含2%B27的NB培養(yǎng)基中，先加入 SB203580孵育1 h，培養(yǎng)液中加入終濃度為125μM的舒巴坦與SB203580繼續(xù)共同孵育48h，之后行OGD，方法同OGD組。根據(jù)SB203580的劑量進(jìn)一步分為2.5μM,5μM和10μM3個(gè)亞組，以觀察其量效關(guān)系。
　　(5)舒巴坦對(duì)照組：先正常培養(yǎng)1 h，再加入終濃度為125μM的舒巴

41、坦孵育48小時(shí)，換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h+24 h。
　　(6)SB203580對(duì)照組：在正常培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10μM的SB203580孵育1+48 h，換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h+24 h。
　　實(shí)驗(yàn)各組于OGD復(fù)氧后24 h或相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，HO/PI染色觀察計(jì)數(shù)神經(jīng)元死亡百分率；MTT法觀察細(xì)胞活力，觀察p38 MAPK抑制劑SB203580對(duì)舒巴坦抗OGD發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用的影響。<

42、br>　　結(jié)果：
　　1.HO/PI雙重染色顯示，與對(duì)照組相比，125μM的舒巴坦單獨(dú)處理正常的共培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的死亡率無影響，2 h的OGD可以顯著增加細(xì)胞死亡率，而125μM的舒巴坦預(yù)孵育48 h可以顯著降低由OGD引起的海馬神經(jīng)元死亡。與舒巴坦+OGD組相比，SB203580+舒巴坦+OGD組應(yīng)用2.5μM，5μM和10μM的SB203580后，細(xì)胞死亡率又明顯升高，這種效應(yīng)呈明顯的劑量依賴性；在SB203580的溶劑對(duì)照組

43、，共培養(yǎng)的細(xì)胞死亡率與舒巴坦+OGD組相比無明顯差異，說明溶劑對(duì)舒巴坦預(yù)孵育對(duì)抗OGD而產(chǎn)生的神經(jīng)元保護(hù)作用無影響。此外，在 SB203580對(duì)照組，與對(duì)照組相比，細(xì)胞死亡率無明顯改變，說明10μM的SB203580對(duì)正常的神經(jīng)元無損傷致死作用。
　　2.MTT的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，2 h的OGD可以顯著降低共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞活力，而舒巴坦可以顯著增加由OGD引起的共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞活力降低。與舒巴坦+OGD組相比，SB20358

44、0+舒巴坦+OGD組中SB203580明顯降低共培養(yǎng)的細(xì)胞活力，且具有劑量依賴性。在SB203580的溶劑對(duì)照組，共培養(yǎng)的細(xì)胞活力與舒巴坦+OGD組相比無明顯差異。在SB203580對(duì)照組，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力無明顯改變。以上結(jié)果結(jié)合HO/PI結(jié)果，說明SB203580可以劑量依賴的抑制舒巴坦預(yù)孵育對(duì)抗OGD而產(chǎn)生的神經(jīng)元保護(hù)作用，p-p38 MAPK通路參與了海馬神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)中舒巴坦對(duì)抗氧葡萄糖剝奪發(fā)揮的神經(jīng)元保護(hù)作用。

45、r>　　小結(jié)：在神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，抑制p38 MAPK通路阻斷舒巴坦介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元抗OGD作用。
　　結(jié)論:
　　1.舒巴坦預(yù)孵育可劑量依賴性的對(duì)抗OGD引起的海馬神經(jīng)元死亡，并可上調(diào)OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)，同時(shí)維持GLT-1的高表達(dá)直至OGD復(fù)氧后24 h，表明舒巴坦預(yù)孵育可能通過上調(diào)并維持星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1的表達(dá)對(duì)抗OGD引起的海馬神經(jīng)元死亡。
　　2.舒巴坦可劑量和時(shí)間依賴性的

46、上調(diào)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞 p-p38 MAPK和GLT-1表達(dá)，且p38的磷酸化活化明顯早于GLT-1表達(dá)上調(diào)。
　　3.抑制p-p38 MAPK阻斷舒巴坦誘導(dǎo)的正常和OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1的上調(diào)，p38 MAPK通路參與了舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的正常和OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)上調(diào)。
　　4.抑制p-p38 MAPK阻斷舒巴坦預(yù)孵育對(duì)抗OGD發(fā)揮的海馬神經(jīng)元保護(hù)作用。
　　5.以上表明，舒巴坦通過激活星形膠