TRPV4通過激活膠質(zhì)細(xì)胞參與次聲引起的神經(jīng)元損傷.pdf

1、背景：次聲是頻率小于20Hz的聲波，它在多種自然環(huán)境和人工環(huán)境中廣泛存在。自然次聲源包括雷暴天氣、湍流、火山噴發(fā)、海嘯、地震等，有研究顯示次聲檢測可能可以用于火山、地震的監(jiān)測和預(yù)警。人造次聲源包括爆破、大型燃燒過程、壓縮機(jī)、航天設(shè)備、大型的工業(yè)設(shè)備和交通工具。由于人們組織器官的固有頻率在次聲的頻率范圍之內(nèi)(例如頭部為8-12Hz)，因此次聲可能通過與細(xì)胞成分產(chǎn)生共振來產(chǎn)生損傷效應(yīng)，嚴(yán)重者可能產(chǎn)生聲相關(guān)疾病(Vibroacoustic d

2、isease，VAD)。隨著工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，次聲越來越成為損害人們健康的環(huán)境污染因素。
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)更容易發(fā)生次聲損傷。我們前期的動物研究發(fā)現(xiàn)，一定頻率和聲壓級的次聲暴露可以損傷動物的學(xué)習(xí)和記憶能力，減少海馬的神經(jīng)發(fā)生，引起海馬神經(jīng)元的凋亡，促進(jìn)大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。我們還發(fā)現(xiàn)，次聲引起的神經(jīng)損傷與鈣離子內(nèi)流增多有關(guān)。但是對次聲腦損傷的確切機(jī)制，我們?nèi)匀恢跎佟Ｊ鞘裁礄C(jī)制，將次聲這種聽覺刺激轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)的生物信號，并進(jìn)一

3、步引起神經(jīng)元損傷的呢？
　　TRPV4是一種對鈣離子通透的非選擇性陽離子通道。我們前期發(fā)現(xiàn)，它作為一種機(jī)械刺激感受分子，在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中有較高表達(dá)，另外次聲暴露后，大鼠腦內(nèi)TRPV4表達(dá)上升。因此，作為后續(xù)研究，本實(shí)驗(yàn)探討了TRPV4分子與次聲引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷之間的關(guān)系。
　　研究目的：1、明確次聲暴露后膠質(zhì)細(xì)胞活化與神經(jīng)元損傷間的關(guān)系；2、明確TRPV4在次聲暴露后膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)元損傷中的作用。

4、>　　研究方法：1、16Hz/130dB次聲處理成年大鼠，在次聲處理的不同時程，處死大鼠，觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量和TUNEL染色陽性的凋亡細(xì)胞數(shù)量。然后向大鼠海馬注射氟代檸檬酸以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，或者腹腔注射米諾環(huán)素以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，觀察相同程度的次聲暴露后，CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量的變化和凋亡情況。2、對體外培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行次聲刺激，在之后不同時間點(diǎn)收集培養(yǎng)液上清，用液相芯片的方法檢測其中細(xì)胞因子含量的變化(IL-1α、IL-

5、1β、IL-6、IL-10、和TNF-α)。然后用次聲處理后膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清處理神經(jīng)元，觀察對其凋亡的影響。最后向次聲處理后膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中，加入IL-1β和TNF-α的中和抗體，觀察對神經(jīng)元凋亡的影響。3、用免疫熒光染色和Western blot的方法觀察次聲處理后，培養(yǎng)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞 TRPV4表達(dá)的變化。4、用 RNAi的方法下調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞TRPV4的表達(dá)，或者用特異性抑制劑RN1734處理膠質(zhì)細(xì)胞，檢測次

6、聲處理后其培養(yǎng)液上清中炎癥因子的含量。然后分別用培養(yǎng)液上清處理神經(jīng)元，觀察對其凋亡的影響。5、用激光共聚焦顯微鏡檢測膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，觀察次聲對鈣離子內(nèi)流的影響。然后在trpv4 siRNA或者RN1734處理的膠質(zhì)細(xì)胞，觀察次聲后胞內(nèi)鈣離子濃度變化，研究 TRPV4對次聲介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流的影響。6、為了了解TRPV4與膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子之間的調(diào)控機(jī)制，我們研究了TRPV4對NF-κB信號分子的影響。我們用Western blot

7、的方法，分別用TRPV4激動劑4α-PDD、抑制劑RN1734和trpv4 siRNA處理膠質(zhì)細(xì)胞，觀察對次聲后NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位和IκB磷酸化的影響。7、為了進(jìn)一步了解次聲后鈣離子內(nèi)流和NF-κB激活之間可能涉及的信號分子，我們分別用鈣調(diào)蛋白抑制劑CGS9343B、蛋白激酶C抑制劑Ro318220、p38 MAPK抑制劑SB20358、JNK抑制劑SP600125、和PI3K抑制劑 LY294002處理體外培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞，觀

8、察對次聲后NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位和IκB磷酸化的影響。
　　研究結(jié)果：1、較長時間的次聲暴露(2h/d，7–14d)引起大鼠海馬神經(jīng)元明顯減少，利用氟代檸檬酸或米諾環(huán)素抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞活化能減少次聲后神經(jīng)元的凋亡。2、次聲暴露使培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子IL-1β和TNF-α水平明顯上升；用上清處理神經(jīng)元，促進(jìn)后者凋亡；向培養(yǎng)液中加IL-1β和TNF-α的中和抗體，能減少神經(jīng)元凋亡。3、T

9、RPV4在膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較高，在神經(jīng)元表達(dá)較低。次聲處理后，培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPV4表達(dá)上調(diào)，而神經(jīng)元中未見明顯改變。4、用 RNAi的方法下調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞 TRPV4的表達(dá)，或者用抑制劑RN1734處理膠質(zhì)細(xì)胞，次聲暴露后膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-1β和TNF-α含量明顯減少，對體外培養(yǎng)的神經(jīng)元的損傷作用也減弱。5、次聲暴露能引起膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。用RNAi的方法下調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞TRPV4的表達(dá)，或者用抑制劑RN173

10、4處理膠質(zhì)細(xì)胞，均抑制了次聲暴露后胞內(nèi)鈣離子濃度升高。6、次聲暴露后，膠質(zhì)細(xì)胞 NF-κB激活，表現(xiàn)為 p65亞基核轉(zhuǎn)位和IκB磷酸化均明顯增強(qiáng)。抑制劑RN1734和trpv4 siRNA處理膠質(zhì)細(xì)胞，能抑制次聲引起的NF-κB激活。7、鈣調(diào)蛋白抑制劑CGS9343B和蛋白激酶C抑制劑Ro318220抑制了次聲暴露后，膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB的活化。而p38 MAPK抑制劑SB20358、JNK抑制劑SP600125、和PI3K抑制劑 LY2