BNIP3-AIF-Endo G通路介導氧葡萄糖剝奪誘導的海馬神經元死亡.pdf

1、腦血管病發(fā)病率高，嚴重危害人類健康。腦中風是目前最常見的危及人類生命的神經系統(tǒng)疾病，是當今第三大死亡原因及首位致殘原因。腦缺血損傷所致的神經元大量死亡是導致中風后神經功能喪失的主要原因，而目前仍未闡明缺血性腦損傷的機制，臨床上也缺乏有效的治療手段。因此，研究缺血性神經元死亡機制，探索新的治療靶點將具有重要意義. 大量證據表明，多種機制參與了缺血性神經細胞死亡，其中包括壞死、凋亡。壞死是一種非程序性快速死亡，而神經元凋亡則是一種高

2、度調節(jié)的程序性死亡，過程較慢，并且該死亡過程是可以通過治療干預來逆轉的。典型性神經元凋亡是通過激活caspases，造成細胞核和胞漿底物的降解及細胞的分解。除此之外，中風后的腦組織中仍廣泛存在另外一種具有不同生化特點的神經細胞死亡形式，這種細胞死亡也是程序性死亡，但不依賴于caspase的激活，稱為非典型性凋亡。國際上對腦缺血激活的caspase依賴性神經元凋亡通路進行了大量而深入的研究，對其分子機理已有了比較明確的認識，然而，目前對非

3、典型性凋亡的分子調節(jié)機制尚不明確。 Bcl-2家族眾多成員參與了細胞損傷過程。其中BNIP3（Bcl-2/E1B-19K相互作用蛋白3）是一種對缺氧最敏感的Bcl-2促凋亡蛋白。Bcl-2家族大多成員均含有為其線粒體定位及誘導細胞死亡所需的BH3結構域和C末端跨膜結構域。BNIP3也含有BH3結構域，但該結構域既不是BNIP3與其他Bcl-2家族成員形成異二聚體所必須的，也不是BNIP3誘導細胞死亡所必需的，這表明BNIP3不

4、同于其他Bcl-2家族蛋白。研究進一步表明，BNIP3誘導細胞死亡的特點是早期質膜通透性增加，線粒體損傷，但不伴隨caspase的激活及細胞色素c的釋放。雖然目前對caspase依賴性細胞死亡通路的機理已有了比較明確的認識，然而，對非典型性凋亡的特點及其分子調節(jié)機制尚不明了。由于BNIP3對缺氧的敏感性以及其誘導非典型性凋亡的特點，我們研究了其在缺血性神經元死亡中的作用及其下游機制。 首先我們用體外培養(yǎng)海馬神經元氧葡萄糖剝奪（O

5、GD）/復氧（R）模型模擬腦缺血來觀察OGD/R過程中BNIP3的變化。取培養(yǎng)12天生長良好的海馬神經元分成三組：control組，不進行任何處理；EBSS組，將Neurobasal培養(yǎng)基換成EBSS平衡液，正常孵育4h后再換回Neurobasal培養(yǎng)基孵育24 h，設計此組的目的是為了排除由于換液操作引起的細胞損傷；OGD/R組：將Neurobasal培養(yǎng)基換成無糖EBSS平衡液，缺氧孵箱中（1%O2）孵育4 h后再換回Neuroba

6、sal培養(yǎng)基正常孵育24 h。結果顯示：control組和EBSS組細胞死亡率分別為10.65±2.69%和10.16±2.94%（p>0.05），而OGD/R組細胞死亡率達到37.71±6.80%（p<0.01）。并且control組和EBSS組細胞活性百分率分別為100.00±6.96%和96.31±6.91%（p>0.05），而OGD/R組則降至46.94±7.02%（p<0.01）?？梢奜GD（4h）/R（24 h）引起明顯的細

7、胞損傷。那么在OGD/R過程中BNIP3表達是否發(fā)生變化以及是如何變化的，我們又分別觀察了復氧后0h，2h，6h，12 h，24 h各個時間點BNIP3的表達，全細胞Western Blot結果顯示：20 KD BNIP3（前體蛋白形式）在OGD/R0h即升高至對照組的2.36±0.33倍，（p<0.01）：30 KD（單體形式）和60 KD（二聚體形式）的BNIP3在OGD/R2 h分別升高至對照組的3.50±0.46倍和1.84±0

8、.31倍，（p<0.01），三種形式的BNIP3均隨著復氧時間的延長而增加，并在OGD/R12 h達到最高值。因為BNIP3主要是通過形成同二聚體插入到線粒體上發(fā)揮其促凋亡功能，我們又進一步觀察了亞細胞器線粒體上BNIP3的變化。結果顯示：20 KD和60 KD的BNIP3在復氧后0h即升高至對照組的2.14±0.23倍和3.42±0.31倍（p<0.01），并隨復氧時間的延長增加，在OGD/R24 h達到最高。而30 KD的BNIP3

9、在線粒體上基本觀察不到。為了驗證升高的BNIP3是否參與細胞損傷，我們觀察過表達BNIP3對細胞死亡的影響。結果顯示：對照組細胞死亡率為22.86±6.82%，而過表達BNIP3可引起細胞死亡率升高至62.46±9.62%（p<0.01），表明過表達BNIP3可引起細胞損傷。并且抑制BNIP3可以使OGD/R12 h后的細胞死亡率由對照組的32.87±1.80%降至18.07±1.46%（p<0.01）及OGD/R24 h后的細胞死亡率

10、由37.25±2.15%降至16.02±1.21%（p<0.01）。以上實驗均證明BNIP3參與了OGD/R誘導的細胞死亡。 BNIP3介導caspase非依賴性細胞凋亡途徑的下游機制尚不明確。研究表明，Endo G（核酸內切酶G）和AIF（凋亡誘導因子）作為線粒體功能障礙的下游分子，同樣參與了caspase非依賴性細胞死亡通路。Endo G和AIF都是線粒體蛋白。Endo G是一種線粒體DNA酶，當其從線粒體釋放出來之后，可

11、以轉位到細胞核，并且以caspase非依賴性方式將染色質DNA剪切為核小體碎片。AIF是一種含氧化還原酶結構域的線粒體黃素蛋白，當其從線粒體釋放出來后可與Endo G結合，共同促進DNA降解及細胞凋亡。這是目前確定的唯一不依賴caspase活性的DNA降解通路。我們研究了Endo G和AIF是否作為BNIP3的下游分子介導OGD/R誘導的細胞凋亡。 首先，我們觀察了OGD/R過程中AIF和Endo G的變化。全細胞Western

12、 Blot結果顯示：AIF和Endo G在OGD/R6 h分別升高至對照組的1.84±0.18倍和1.54±0.18倍，（p<0.01）。隨復氧時間的延長表達上調，并在OGD/R12 h最高。以往實驗證明AIF和Endo G在細胞受到損傷后由線粒體釋放轉位到核上發(fā)揮促凋亡功能，我們又進一步分別觀察OGD/R后AIF和Endo G的核轉位。結果顯示：線粒體AIF和Endo G在OGD/R2 h表達分別降至對照組0.63±0.12倍和0.5

13、8±0.80倍，（p<0.01），并隨復氧時間的延長增加，在OGD/R24 h降至最低；而相應核中AIF和Endo G在OGD/R2 h表達分別升高至對照組的1.60±0.11倍和3.62±0.41倍（p<0.01），在OGD/R12 h最高。說明OGD/R過程中AIF和Endo G可能由線粒體轉位到核。為進一步研究AIF/Endo G核轉位和細胞死亡之間的關系，我們分別觀察了OGD/R后各個時間點的核轉位率和細胞死亡率，結果證明OGD

14、/R12 h細胞死亡率具有顯著性差異，而AIF和Endo G的核轉位在OGD/R2h即呈現(xiàn)顯著性差異，提前于細胞死亡之前，表明AIF和Endo G核轉位發(fā)生在細胞死亡之前，提示AIF和EndoG核轉位可能是細胞損傷的誘導因素而不是伴隨現(xiàn)象。 其次，為研究BNIP3和AIF/Endo G核轉位的關系，我們過表達BNIP3來觀察對AIF/Endo G核轉位的影響。結果顯示：過表達BNIP3可以引起核AIF轉位由對照組的30.44±5

15、.57%升高到70.12±7.51%（p<0.01）；核Endo G轉位由25.92±3.99%升高到60.01±8.51%（p<0.01）。可見過表達BNIP3可以誘導AIF和Endo G發(fā)生核轉位。并且抑制BNIP3表達也得出一致的結論，抑制BNIP3表達可以使OGD/R2 h后AIF核轉位由24.58±3.39%降低到12.5±3.66%（p<0.01），使OGD/R6 h由51.67±5.60%降低到29.29±6.74%（p<

16、0.01）。以上實驗均證明AIF/Endo G可能是BNIP3的下游分子。 再次，我們在來源于Harlequin（Hq）C57小鼠的海馬神經元上再次對AIF是否是BNIP3的下游分子進行驗證。這種小鼠AIF表達降低大約80%。過表達BNIP3可以引起野生型C57海馬神經元死亡率由對照組的2.13±5.32%升高到58.86±6.50%，但僅引起Hq C57海馬神經元死亡由對照組的23.25±4.95%升高到35.38±6.19%

17、，升高的幅度有了明顯降低（p<0.01）?？梢娤抡{AIF降低過表達BNIP3引起的細胞死亡，進一步證明AIF是BNIP3的下游分子。并且AIF下調并不影響B(tài)NIP3的表達，OGD（4 h）/R（24 h）后仍可見BNIP3表達升高。OGD/R不能誘導Hq C57海馬神經元出現(xiàn)顯著性死亡，表明在OGD/R中AIF是一個重要的下游分子。 綜上所述，OGD/R引起B(yǎng)NIP3表達升高并插入到線粒體上，繼而誘導AIF和Endo G由線粒體