枸杞多糖對海馬神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用及對PARP-1-AIF介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的抑制研究.pdf

1、目的：觀察枸杞多糖(lycium barbarumpolysaccharide,LBP)對原代培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制與抗凋亡的關(guān)系。
　　方法：1.以原代培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元為研究對象，用無糖培養(yǎng)液結(jié)合物理性缺氧建立氧糖剝奪再灌注損傷模型；通過神經(jīng)元特異性烯醇化酶熒光染色，鑒定神經(jīng)細(xì)胞。
　　2.MTT酶反應(yīng)法測定神經(jīng)細(xì)胞存活率，化學(xué)比色法測定神經(jīng)細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)漏

2、出率以及NAD含量的變化。
　　3.應(yīng)用Hoechst33342染色法、AnnexinV-FITC/PI法檢測原代培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。
　　4.使用激光共聚焦技術(shù)測定神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子含量以及線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential，MMP）水平的變化。
　　5.使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA Ladder。
　　6.免疫蛋白印跡技術(shù)和實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢

3、測凋亡相關(guān)因子PARP-1，AIF和Endo G的蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.與正常組比較，模型組可顯著提高LDH的漏出率(P<0.01)，降低神經(jīng)細(xì)胞的存活率(P<0.01)以及NAD的含量（P<0.001）；與模型組比較，枸杞多糖治療組(10、20、40 mg/L)可顯著降低LDH的漏出率(P<0.05，P<0.01)，提高海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活率(P<0.01)以及NAD的含量（P<0.01，P<0.001）。

4、　　2.與正常組比較,Hoechst33342和AnnexinV-FITC/PI法檢測顯示神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.001)；與模型組比較，枸杞多糖治療組(10、20、40mg/L)可顯著降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率(P<0.01，P<0.001)。
　　3.與正常組比較，模型組可顯著提高海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的含量(P<0.01)，降低線粒體膜電位的熒光值(P<0.01)；與模型組比較，枸杞多糖治療組(10、20、40mg/L)

5、可顯著降低海馬神經(jīng)元內(nèi)游離鈣離子的含量(P<0.05，P<0.01)，穩(wěn)定線粒體膜電位(P<0.01)。
　　4.與正常組比較，模型組出現(xiàn)大量的DNA斷裂片段；與模型組相比，枸杞多糖治療組(10、20、40mg/L)對DNA梯度有不同程度的緩解。
　　5.與正常組比較，模型組中大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞PARP-1和AIF的蛋白水平明顯上調(diào)，而Endo G蛋白水平明顯下調(diào)，有顯著性差異(P<0.001，P<0.001，P<0.01)；

6、與模型組比較，枸杞多糖治療組(40mg/L)可明顯抑制PARP-1(P<0.001)和AIF(P<0.01)蛋白表達(dá)，增強(qiáng)Endo G蛋白的表達(dá)(P<0.05)。
　　6.與正常組比較，模型組中大鼠海馬神經(jīng)元PARP-1、AIF和Endo G的mRNA水平明顯上調(diào)，有顯著性差異(P<0.001，P<0.01，P<0.01)；與模型組比較，枸杞多糖治療組(40mg/L)可明顯抑制PARP-1(P<0.01)，AIF(P<0.05)和