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文檔簡介
1、目的:觀察枸杞多糖(lycium barbarumpolysaccharide,LBP)對原代培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用,并探討其作用機(jī)制與抗凋亡的關(guān)系。
方法:1.以原代培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元為研究對象,用無糖培養(yǎng)液結(jié)合物理性缺氧建立氧糖剝奪再灌注損傷模型;通過神經(jīng)元特異性烯醇化酶熒光染色,鑒定神經(jīng)細(xì)胞。
2.MTT酶反應(yīng)法測定神經(jīng)細(xì)胞存活率,化學(xué)比色法測定神經(jīng)細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)漏
2、出率以及NAD含量的變化。
3.應(yīng)用Hoechst33342染色法、AnnexinV-FITC/PI法檢測原代培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。
4.使用激光共聚焦技術(shù)測定神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子含量以及線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential,MMP)水平的變化。
5.使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA Ladder。
6.免疫蛋白印跡技術(shù)和實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢
3、測凋亡相關(guān)因子PARP-1,AIF和Endo G的蛋白和mRNA的表達(dá)。
結(jié)果:1.與正常組比較,模型組可顯著提高LDH的漏出率(P<0.01),降低神經(jīng)細(xì)胞的存活率(P<0.01)以及NAD的含量(P<0.001);與模型組比較,枸杞多糖治療組(10、20、40 mg/L)可顯著降低LDH的漏出率(P<0.05,P<0.01),提高海馬神經(jīng)細(xì)胞的存活率(P<0.01)以及NAD的含量(P<0.01,P<0.001)。
4、 2.與正常組比較,Hoechst33342和AnnexinV-FITC/PI法檢測顯示神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.001);與模型組比較,枸杞多糖治療組(10、20、40mg/L)可顯著降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率(P<0.01,P<0.001)。
3.與正常組比較,模型組可顯著提高海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的含量(P<0.01),降低線粒體膜電位的熒光值(P<0.01);與模型組比較,枸杞多糖治療組(10、20、40mg/L)
5、可顯著降低海馬神經(jīng)元內(nèi)游離鈣離子的含量(P<0.05,P<0.01),穩(wěn)定線粒體膜電位(P<0.01)。
4.與正常組比較,模型組出現(xiàn)大量的DNA斷裂片段;與模型組相比,枸杞多糖治療組(10、20、40mg/L)對DNA梯度有不同程度的緩解。
5.與正常組比較,模型組中大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞PARP-1和AIF的蛋白水平明顯上調(diào),而Endo G蛋白水平明顯下調(diào),有顯著性差異(P<0.001,P<0.001,P<0.01);
6、與模型組比較,枸杞多糖治療組(40mg/L)可明顯抑制PARP-1(P<0.001)和AIF(P<0.01)蛋白表達(dá),增強(qiáng)Endo G蛋白的表達(dá)(P<0.05)。
6.與正常組比較,模型組中大鼠海馬神經(jīng)元PARP-1、AIF和Endo G的mRNA水平明顯上調(diào),有顯著性差異(P<0.001,P<0.01,P<0.01);與模型組比較,枸杞多糖治療組(40mg/L)可明顯抑制PARP-1(P<0.01),AIF(P<0.05)和
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