自噬在原代培養(yǎng)神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注模型中的保護作用.pdf

1、腦卒中，是一類病理機制復(fù)雜，由腦部血供障礙引起腦血管疾病并且目前尚無有效臨床治療手段。自噬是細(xì)胞通過溶酶體機制對胞內(nèi)成分的分解代謝過程。雖有證據(jù)表明腦缺血過程中伴隨自噬現(xiàn)象，然而它在缺血性腦損傷中的作用及其調(diào)控機制均不清楚。
　　目的:利用小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元氧糖剝奪再灌(Oxygen-glucosedeprivation/Reperfusion，OGD/Rep)模型，明確自噬在缺血性腦損傷中的作用;初步探索Bnip3L(NIX

2、)是否參與腦缺血再灌注誘導(dǎo)的線粒體自噬。
　　方法:[1]關(guān)于自噬在原代培養(yǎng)神經(jīng)元OGD/Rep.中作用的研究:(1)在小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元OGD/Rep.實驗中，于再灌0，1，3，6，12，24 h后用Western blot檢測LC3-Ⅱ和p62/SQSTM1(p62)的蛋白水平，并且對不同再灌時間的神經(jīng)元自噬泡數(shù)量進行統(tǒng)計。(2)于OGD2 h后的復(fù)灌過程中給予神經(jīng)元自噬抑制劑3-MA（或自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin）和巴

3、弗洛霉素A1，復(fù)灌24 h后采用MTT檢測細(xì)胞存活率。另外，利用siRNA技術(shù)干擾了自噬相關(guān)基因Atg7的表達，同樣在復(fù)灌24 h后采用MTT檢測細(xì)胞存活率，并利用Western blot檢測Caspase-3的方法檢測凋亡水平。(3)于OGD復(fù)灌過程中給予神經(jīng)元自噬抑制劑3-MA:神經(jīng)元OGD/Rep.實驗中，在復(fù)灌1，3，6h后細(xì)胞線粒體和自噬泡分別用Mitotracker Red和LC3免疫染色標(biāo)記，并定量兩者的重合程度。在復(fù)灌6

4、h后采用定量PCR技術(shù)利用線粒體DNA編碼基因ATPase6與基因組DNA編碼基因Rpl13之比表征單位細(xì)胞/組織內(nèi)的線粒體數(shù)量。利用siRNA技術(shù)干擾Atg7的表達，分離出線粒體蛋白部分和胞漿蛋白部分并利用Western blot檢測線粒體自噬水平以及凋亡水平。[2]探索Nix是否參與OGD/Rep.過程中的線粒體自噬的研究:實驗動物分為三組:BALB/CbYj野生型組(Nix+/+），雜合子組(Nix+/-），純合子組(Nix-/-

5、)。對各組小鼠施行局灶性腦缺血(MCAO)手術(shù)，60 min后再灌。于再灌6h后用Western blot檢測缺血半暗帶腦組織線粒體自噬水平。
　　結(jié)果:[1]在神經(jīng)元OGD/Rep.過程中，自噬被逐漸激活。[2]抑制自噬加重OGD/Rep.誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷以及細(xì)胞凋亡。[3]神經(jīng)元OGD/Rep.誘導(dǎo)自噬依賴的線粒體清除。[4]抑制線粒體自噬進一步上調(diào)了細(xì)胞色素C釋放。[5] Nix基因敲除小鼠的線粒體自噬水平在腦缺血再灌注過程中