氧糖剝奪再灌注后Hsp20的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、第一章氧糖剝奪再灌注后Hsp20的表達(dá)變化。
　　 目的：探討氧糖剝奪再灌注后細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及Hsp20的表達(dá)變化，并觀察氧糖剝奪再灌注后線粒體、高爾基體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，為下一步研究Hsp20的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：小鼠腦神經(jīng)瘤N2a細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪再灌注后，采用MTT法檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的變化；并采用免疫熒光技術(shù)研究高爾基體、線粒體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，采用Western b

2、lot及實時定量PCR檢測Hsp20與高爾基體蛋白GM130的蛋白基因表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：1.氧糖剝奪4小時并再灌注12及24小時后，N2a細(xì)胞的活力明顯下降(P<0.01)。同時，氧糖剝奪4小時并再灌注6、12及24小時后，N2a細(xì)胞的凋亡率明顯增高(P<0.05)。
　　 2.氧糖剝奪4小時并再灌注0小時及6小時后，Hsp20的蛋白及基因表達(dá)水平與基礎(chǔ)水平比較明顯下降(P<0.05)。再灌注12小時及24小時后，

3、則回到基礎(chǔ)水平。
　　 3.氧糖剝奪4小時并再灌注0小時及6小時后，絲氨酸磷酸化Hsp20蛋白與總Hsp20蛋白的比值，與基礎(chǔ)水平比無顯著性差異。再灌注12小時及24小時后，其比值則比基礎(chǔ)水平明顯增高(P<0.05)。
　　 4.氧糖剝奪再灌注后，高爾基體蛋白GM130的蛋白及基因表達(dá)、高爾基體形態(tài)均未見明顯變化，而線粒體則發(fā)生了碎裂，相互間緊密連接消失。
　　 結(jié)論：氧糖剝奪再灌注后，N2a細(xì)胞的活力明顯受損，

4、凋亡率增高，Hsp20及磷酸化Hsp20的表達(dá)受氧糖剝奪再灌注的調(diào)節(jié)，同時線粒體發(fā)生了碎裂，但高爾基體形態(tài)及GM130的表達(dá)并未發(fā)現(xiàn)明顯變化。
　　 第二章 Hsp20野生型及其突變體的構(gòu)建和表達(dá)。
　　 目的：構(gòu)建Hsp20野生型、Ser16磷酸化突變體Hsp20S16D及Ser16去磷酸化突變體Hsp20S16A的表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究Hsp20的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制做好前期準(zhǔn)備工作。
　　 方法：使用小鼠腦

5、神經(jīng)瘤N2a細(xì)胞抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用特異性Hsp20引物和帶突變位點的長引物進(jìn)行PCR，以獲得Hsp20的CDS序列，將帶有酶切位點的PCR產(chǎn)物，連接到pEGFP-N1表達(dá)載體中，經(jīng)過酶切鑒定和測序證實其正確性。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染到N2a細(xì)胞中，通過免疫熒光和免疫印跡，觀察Hsp20野生型、Ser16磷酸化突變體Hsp20S16D及Ser16去磷酸化突變體Hsp20S16A表達(dá)質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：通

6、過PCR法成功獲得小鼠Hsp20 CDS序列，并成功連接到pEGFP-N1表達(dá)載體中，經(jīng)測序和酶切鑒定正確。免疫熒光證實Hsp20野生型、Ser16磷酸化突變體Hsp20S16D及Ser16去磷酸化突變體Hsp20S16A表達(dá)分布相同，免疫印跡顯示構(gòu)建的Hsp20野生型和突變體能成功表達(dá)且分子量大小正確。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了Hsp20野生型、Ser16磷酸化突變體Hsp20S16D及Ser16去磷酸化突變體Hsp20S16A

7、的表達(dá)質(zhì)粒，為下一步研究Hsp20的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三章 Hsp20的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 目的：研究氧糖剝奪再灌注后Hsp20的神經(jīng)保護(hù)作用并探討其可能機(jī)制。
　　 方法：將構(gòu)建成功的Hsp20野生型、Ser16磷酸化突變體Hsp20S16D及Ser16去磷酸化突變體Hsp20S16A的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠腦神經(jīng)瘤N2a細(xì)胞，各組細(xì)胞經(jīng)歷氧糖剝奪再灌注后，采用MTT法、流式細(xì)胞技術(shù)

8、及免疫熒光技術(shù)，檢測細(xì)胞活力、凋亡率及線粒體的變化，并采用Western blot技術(shù)檢測Bax，Bc1-2及細(xì)胞色素C的釋放變化，探討Hsp20在保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞線粒體凋亡通路中的作用。
　　 結(jié)果：1.轉(zhuǎn)染Hsp20野生型及Ser16磷酸化突變體Hsp20S16D的細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪4小時并再灌注12及24小時后，與空載體相比，細(xì)胞活力增高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率下降(P<0.01)。
　　 2.轉(zhuǎn)染Ser16去磷酸化突

9、變體Hsp20S16A的細(xì)胞，經(jīng)氧糖剝奪再灌注后，其細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡率與空載體組相比沒有顯著性差異。
　　 3.轉(zhuǎn)染Hsp20野生型及Ser16磷酸化突變體Hsp20S16D的細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪再灌注后，線粒體的碎裂程度明顯降低，而轉(zhuǎn)染Ser16去磷酸化突變體Hsp20S16A的細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)線粒體碎裂程度較空載體組則并未見明顯區(qū)別。
　　 4.轉(zhuǎn)染Hsp20野生型及Ser16磷酸化突變體Hsp20S16D的細(xì)胞經(jīng)氧糖剝奪

10、再灌注后，Bcl-2的表達(dá)水平增高，Bax的表達(dá)水平下降，從線粒體釋放到胞漿中的細(xì)胞色素C減少(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染Ser16去磷酸化突變體Hsp20S16A細(xì)胞中Bax，Bcl-2及細(xì)胞色素C的表達(dá)，與空載體組相比則沒有顯著性差異。
　　 結(jié)論：1.Hsp20在氧糖剝奪再灌注中具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 2.Hsp20在氧糖剝奪再灌注中的神經(jīng)保護(hù)作用與Ser16磷酸化有關(guān)，阻斷Ser16磷酸化則其不再具有神經(jīng)保護(hù)作用。