黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖-復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響.pdf

1、第一部分
　　 黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Caspase-表達(dá)的影響
　　 目的:觀察黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因Caspase-3表達(dá)的影響。
　　 方法:取原代培養(yǎng)8d的大鼠海馬神經(jīng)元,隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、黃芪注射液溶劑對(duì)照組、缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組和黃芪注射液組。除正常對(duì)照組外均進(jìn)行缺氧缺糖0.5h再?gòu)?fù)氧復(fù)糖,各組于復(fù)氧復(fù)糖后0h、0.5h、2h、6h、24

2、h、48h、72h和120h采用免疫組織化學(xué)染色法和蛋白免疫印跡(western blotting)法檢測(cè)海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白的表達(dá),并采用原位雜交和RT-PCR方法檢測(cè)海馬神經(jīng)元Caspase-3 mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:正常對(duì)照組大鼠海馬神經(jīng)元核規(guī)整,細(xì)胞突起明顯,有少許細(xì)胞胞漿黃染。缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組大鼠海馬神經(jīng)元核皺縮、突起回縮,大量細(xì)胞胞漿黃染,胞核內(nèi)有黃色顆粒,陰性對(duì)照組未見(jiàn)

3、胞漿和突起黃染的陽(yáng)性神經(jīng)元。黃芪注射液溶劑對(duì)照組海馬神經(jīng)元亦可見(jiàn)到明顯的核皺縮、突起回縮和胞漿黃染,海馬Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的變化與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組相一致。黃芪注射液組大鼠海馬神經(jīng)元有輕微核皺縮,可見(jiàn)部分神經(jīng)元胞漿黃染。隨著復(fù)氧復(fù)糖時(shí)間的延長(zhǎng),缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組、黃芪注射液溶劑對(duì)照組及黃芪注射液組均可見(jiàn)到陽(yáng)性神經(jīng)元胞核中黃色顆粒逐漸增多,于24h達(dá)到高峰。與正常對(duì)照組相比,除0h和0.5h之外,缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組在

4、2h、6h、24h、48h、72h和120h各時(shí)間點(diǎn)海馬Caspase-3陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目、占神經(jīng)元總數(shù)的百分率及平均光密度值均明顯增多(P<0.05),于24h達(dá)到高峰。黃芪注射液溶劑對(duì)照組以上各個(gè)指標(biāo)的變化趨勢(shì)均與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組相一致(P>0.05)。除0h和0.5h之外,黃芪注射液組各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目、占神經(jīng)元總數(shù)的百分率及平均光密度值均比缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組顯著減少(P<0.05)。原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示:Caspase-

5、3 mRNA陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)、數(shù)目、占神經(jīng)元總數(shù)的百分率及平均光密度值的變化趨勢(shì)與Caspase-3蛋白的變化趨勢(shì)完全一致。Western blotting結(jié)果顯示:除0h和0.5h外,各時(shí)間點(diǎn)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白的平均灰度值均較正常對(duì)照組明顯增加(P<0.05),復(fù)氧復(fù)糖24h平均灰度值最高；與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組相比,黃芪注射液溶劑對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3蛋白的平均灰度值無(wú)明顯變化(P>0.05

6、),而黃芪注射液組除0h和0.5h外,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Caspase-3蛋白的平均灰度值明顯降低(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示:除0h和0.5h外,各時(shí)間點(diǎn)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組海馬神經(jīng)元Caspase-3 mRNA的平均光密度值均較正常對(duì)照組明顯增加(P<0.05),24h平均光密度值最高；與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組相比,黃芪注射液溶劑對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3 mRNA的平均光密度值無(wú)明顯變化(P>0.05),而黃芪注射液組在除

7、0h和0.5h外的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Caspase-3 mRNA的平均光密度值均明顯降低(P<0.05)。
　　 小結(jié):黃芪注射液可抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá),從而抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。
　　 第二部分
　　 JNK抑制劑對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Caspase-3表達(dá)的影響
　　 目的:觀察JNK抑制劑(SP600125)對(duì)凋亡相關(guān)基因

8、Caspase-3表達(dá)的影響。
　　 方法:取原代培養(yǎng)8d的大鼠海馬神經(jīng)元,隨機(jī)分為7組:正常對(duì)照組、缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組、黃芪注射液溶劑對(duì)照組、黃芪注射液組、DMSO組(二甲基亞砜組即SP600125溶劑組)、SP600125組、SP600125+黃芪注射液組。除正常對(duì)照組外,其余各組進(jìn)行缺氧缺糖0.5h再?gòu)?fù)氧復(fù)糖,并于復(fù)氧復(fù)糖后6h、24h、72h采用蛋白免疫印跡和RT-PCR方法檢測(cè)海馬神經(jīng)元Caspase-3的表達(dá)。

9、r>　　 結(jié)果:Western blotting結(jié)果顯示:缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組在6h、24h、72h海馬神經(jīng)元Caspase-3蛋白平均灰度值均較正常對(duì)照組明顯增加(P<0.05);與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組相比,黃芪注射液溶劑對(duì)照組、DMSO組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3蛋白平均灰度值無(wú)明顯變化(P>0.05),而黃芪注射液組、SP600125組、SP600125+黃芪注射液組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Caspase-3蛋白平均灰度值均明顯降低(P<0

10、.05),但此三組之間無(wú)明顯差別(P>0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示:缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組在6h、24h、72h海馬神經(jīng)元Caspase-3mRNA平均光密度值均較正常對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組相比,黃芪注射液溶劑對(duì)照組、DMSO組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3mRNA平均光密度值無(wú)明顯變化(P>0.05),而黃芪注射液組、SP600125組、SP600125+黃芪注射液組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Caspase-3mRNA

11、平均光密度值均明顯降低(P<0.05),但此三組之間無(wú)明顯差別(P<0.05)。
　　 小結(jié):黃芪注射液可通過(guò)抑制JNK3信號(hào)通路的激活而減少Caspase-3的表達(dá),從而抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。
　　 第三部分
　　 黃芪注射液抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的作用機(jī)制
　　 目的:探討黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖致大鼠海馬神經(jīng)元鈣調(diào)蛋白(CaM)的表達(dá)、超氧化物歧化酶(S

12、OD)活性和丙二醛(MDA)含量的影響。
　　 方法:取原代培養(yǎng)8d的大鼠海馬神經(jīng)元,隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組、黃芪注射液溶劑對(duì)照組和黃芪注射液組。除正常對(duì)照組外均進(jìn)行缺氧缺糖0.5h再?gòu)?fù)氧復(fù)糖,各組于復(fù)氧復(fù)糖后0h、0.5h、2h、6h、24h、48h、72h和120h采用蛋白免疫印跡和RT-PCR法檢測(cè)海馬神經(jīng)元鈣調(diào)蛋白(CaM)及CaM mRNA的表達(dá),并用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定各組海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)超氧化物

13、歧化酶(SOD)的活性,用TBA比色法檢測(cè)丙二醛(MDA)的含量。
　　 結(jié)果:western blotting結(jié)果顯示:復(fù)氧復(fù)糖后0h、0.5h、2h、6h、24h、48h、72h和120h各時(shí)間點(diǎn)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組海馬神經(jīng)元CaM蛋白表達(dá)條帶平均灰度值均較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)；與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組相比,黃芪注射液溶劑對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)CaM蛋白的平均灰度值無(wú)明顯變化(P>0.05),而黃芪注射液組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)C

14、aM蛋白的平均灰度值明顯降低(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示:各時(shí)間點(diǎn)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組海馬神經(jīng)元CaM mRNA的平均光密度值均較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.05);與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組相比,黃芪注射液溶劑對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)CaMmRNA的平均光密度值無(wú)明顯變化(P>0.05),而黃芪注射液組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)CaM mRNA的平均光密度值明顯升高(P<0.05)。SOD活性和MDA含量檢測(cè)結(jié)果顯示:各時(shí)間點(diǎn)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組海馬神

15、經(jīng)元SOD活性均較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.05),MDA含量明顯升高(P<0.05)；與缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖組相比,黃芪注射液溶劑對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)SOD的活性、MDA含量無(wú)明顯變化(P>0.05),而黃芪注射液組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)SOD的活性明顯升高(P<0.05),MDA含量明顯降低(P<0.05)。
　　 小結(jié):黃芪注射液可抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元自由基的生成與釋放,抑制鈣超載,從而抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元

16、的凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1黃芪注射液可抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達(dá),從而抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。
　　 2黃芪注射液可通過(guò)抑制JNK3信號(hào)通路的激活而減少Caspase-3的表達(dá),從而抑制缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡。
　　 3黃芪注射液能夠升高海馬神經(jīng)元缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖后SOD活力、降低MDA含量,抑制自由基的生成與釋放,