大鼠缺血性腦損傷相關(guān)微小RNA的篩選研究.pdf

1、目的:
　　在細(xì)胞水平建立胎鼠神經(jīng)元氧/葡萄糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型，通過(guò)微小RNA（microRNAs，miRNA）表達(dá)譜芯片篩選出與胎鼠神經(jīng)元OGD模型相關(guān)的miRNA。構(gòu)建大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，驗(yàn)證大鼠腦梗死組織中差異表達(dá)的miRNA，從而為探索miRNA是否參與及如何參與缺血性腦損傷提供理論基礎(chǔ)

2、，并進(jìn)一步為臨床缺血性卒中的治療提供新的依據(jù)。
　　方法與結(jié)果:
　　一、SD大鼠胎鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)、OGD模型建立及miRNA篩選研究
　　孕17-18d SD大鼠麻醉剖腹取出胎鼠，在無(wú)菌條件下斷頭取腦，分離出大腦皮層，將皮層組織剪碎，0.125％胰蛋白酶消化15-17min，完全培養(yǎng)基終止消化;離心、取沉淀，吹打成細(xì)胞懸液，400目鋼紗過(guò)濾，按照每孔7×105個(gè)細(xì)胞種植到多聚賴(lài)氨酸包被的6孔板中;37℃5％CO2培

3、養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天半量換液一次。將培養(yǎng)第9d的神經(jīng)細(xì)胞隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組和OGD組，OGD組培養(yǎng)液全量換為不含糖的DMEM培養(yǎng)基，使用95％N2+5％CO2混合氣體進(jìn)行OGD損傷，半小時(shí)后更換成正常培養(yǎng)基，37℃5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)24h。對(duì)照組不處理繼續(xù)培養(yǎng)24h。抽提對(duì)照組和OGD組神經(jīng)元RNA，進(jìn)行miRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)顯示，神經(jīng)元接種4h時(shí)即基本貼壁，24h時(shí)細(xì)胞完全貼壁，形態(tài)呈圓形、橢圓形，胞體周

4、圍光暈明顯，突起進(jìn)一步伸長(zhǎng)，細(xì)胞之間連接少，第9d時(shí)神經(jīng)元突起增長(zhǎng)增粗、分支少、胞體明顯增大。芯片結(jié)果顯示，有7個(gè)miRNA表達(dá)明顯下調(diào)，10個(gè)miRNA表達(dá)明顯上調(diào)。根據(jù)芯片結(jié)果，選擇5個(gè)差異表達(dá)的miRNA（上調(diào):miR-134-5p、miR-130a-5p;下調(diào):miR-29b-1-5p、miR-128-2-5p、miR-338-3p）進(jìn)行下一步組織實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymer

5、ase chain reaction，qRT-PCR)驗(yàn)證。
　　二、SD大鼠MCAO模型建立及相關(guān)miRNA的驗(yàn)證研究
　　將26只體重200-240gSD大鼠分為三組:對(duì)照組(n=8)、假手術(shù)組(n=8)和MCAO組(n=10)。MCAO組大鼠麻醉后固定，取頸正中切口，精細(xì)分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在頸外動(dòng)脈近心端剪一小口，將提前準(zhǔn)備好的線栓穿入頸總動(dòng)脈分叉處，進(jìn)

6、入頸內(nèi)動(dòng)脈，至大腦中動(dòng)脈開(kāi)口處，進(jìn)線長(zhǎng)度約18mm，缺血2h后拔出線栓，恢復(fù)頸總和頸內(nèi)動(dòng)脈供血，縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠除不閉塞血管其余步驟與MCAO組一致，對(duì)照組不予任何處理。待再灌注24h后取腦行TTC染色。取三組大鼠腦組織，對(duì)照組和假手術(shù)組取梗死同側(cè)大腦皮層組織，MCAO組取梗死側(cè)及對(duì)側(cè)大腦皮層組織，抽提組織RNA，進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示:第一，線栓法建立MCAO模型成功;第二，qRT-PCR組織驗(yàn)證的5個(gè)miRNA，mi

7、R-134-5p、miR-130a-5p在梗死腦組織中表達(dá)明顯上調(diào)，miR-29b-1-5p、miR-128-2-5p、miR-338-3p在梗死組織中明顯下調(diào)，結(jié)果與芯片基本一致。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)胎鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)及成功建立神經(jīng)元OGD模型，應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)，篩選出大鼠皮層神經(jīng)元OGD損傷后差異性表達(dá)明顯的17個(gè)miRNA，其中10個(gè)miRNA上調(diào)，7個(gè)miRNA下調(diào)。
　　通過(guò)線栓栓塞法成功建立大鼠MC