鈉尿肽信號(hào)通路上調(diào)對(duì)肝郁脾虛大鼠胃Cajal細(xì)胞丟失的影響.pdf

1、目的:
　　探討鈉尿肽信號(hào)通路在肝郁脾虛胃腸運(yùn)動(dòng)障礙大鼠胃ICC丟失中的作用，為肝郁脾虛胃腸運(yùn)動(dòng)障礙的臨床治療提供新思路。
　　方法:
　　1.首先用慢性輕度不可預(yù)知刺激聯(lián)合單籠喂養(yǎng)建立肝郁脾虛大鼠模型。然后檢測(cè)造模前后兩組大鼠的體重變化，用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、糖水偏好實(shí)驗(yàn)檢測(cè)造模前后大鼠行為學(xué)變化，檢測(cè)胃殘留率間接檢測(cè)胃排空功能，檢測(cè)尿D-木糖排泄率觀察小腸的吸收功能，用以上方法進(jìn)行模型鑒定。
　　2.用Western-

2、blotting方法檢測(cè)肝郁脾虛大鼠胃中三種鈉尿肽受體(Natriuretic peptide receptor A，B，C)和c-kit及其配體干細(xì)胞因子(Stem cellfactor, SCF)蛋白表達(dá)情況。用Real-Time PCR方法檢測(cè)肝郁脾虛大鼠胃中三種鈉尿肽受體(NPR-A，B，C)和c-kit及其配體SCF基因表達(dá)的變化情況。
　　3.提取正常SD大鼠的胃平滑肌細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定并培養(yǎng)。用cA

3、NF（一種特異性的NPR-C激動(dòng)劑）、8-Brom-cGMP(8-Br-cGMP，一種膜通透性cGMP類似物)和不同濃度的C型鈉尿肽(C-type natriureticpeptide，CNP)處理培養(yǎng)的正常胃平滑肌細(xì)胞，然后用Western-blotting方法檢測(cè)細(xì)胞中SCF表達(dá)的差異。用MTT比色法檢測(cè)不同濃度的cANF處理正常培養(yǎng)的胃平滑肌細(xì)胞后其增殖情況的變化。
　　結(jié)果:
　　1.肝郁脾虛模型組大鼠一般狀態(tài)差;體

4、重增長(zhǎng)緩慢;曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的修飾次數(shù)、站立次數(shù)、穿格次數(shù)均顯著減少，糖水偏好率下降，說(shuō)明大鼠自主探索能力下降，自主活動(dòng)減少;胃殘留率高于正常組，說(shuō)明胃排空功能下降;尿D-木糖排泄率下降說(shuō)明小腸吸收功能差。
　　2.Western-blotting結(jié)果顯示，與正常組相比，肝郁脾虛模型組大鼠胃中鈉尿肽受體(NPR-A,B，C)蛋白表達(dá)上調(diào)，c-kit及其配體SCF蛋白表達(dá)下調(diào)。RT-PCR結(jié)果顯示，肝郁脾虛大鼠胃中NPR-A，B，C基因表

5、達(dá)均上調(diào)，c-kit及SCF基因表達(dá)下調(diào)，變化趨勢(shì)與蛋白表達(dá)情況一致。
　　3.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈黃棕色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，陰性細(xì)胞胞漿無(wú)色透明，細(xì)胞核同樣染成藍(lán)色。用不同濃度的CNP(10-8，10-7，10-6mol/L)處理培養(yǎng)的胃平滑肌細(xì)胞后，高濃度的CNP（10-7，10-6 mol/L）使細(xì)胞中SCF表達(dá)下調(diào)。用相同濃度(10-6 mol/L)的CNP、8-Br-cGMP、cANF處理細(xì)胞后，結(jié)果顯示CN

6、P及8-Br-cGMP使細(xì)胞中SCF表達(dá)下調(diào)。MTT結(jié)果顯示，用不同濃度的cANF（10-8,10-7，10-6 mol/L）處理正常細(xì)胞后，高濃度的cANF(10-7，10-6 mol/L)會(huì)抑制細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論:
　　1.用慢性輕度不可預(yù)知刺激聯(lián)合單籠喂養(yǎng)可以成功制備肝郁脾虛證動(dòng)物模型;2.在肝郁脾虛大鼠胃中鈉尿肽信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)，同時(shí)SCF/c-kit信號(hào)通路下調(diào);3.CNP/NPR-A，B/cGMP信號(hào)通路使S