硫化氫通過上調(diào)BDNF-TrkB通路拮抗同型半胱氨酸誘導(dǎo)HT22細(xì)胞自噬.pdf

1、目的：本研究以同型半胱氨酸(Homocysteine Hcy)處理的HT22細(xì)胞作為細(xì)胞自噬模型，探討硫化氫(Hydrogen sulfide H2S)是否可通過上調(diào)BDNF-TrkB通路拮抗同型半胱氨酸誘導(dǎo)HT22細(xì)胞自噬。
　　方法：1、蛋白免疫印跡法（Western Bloting）法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3II/I比值、P62、Beclin-1蛋白的表達(dá)和電鏡檢測(cè)自噬結(jié)構(gòu)確定Hcy是否能夠誘導(dǎo)HT22細(xì)胞自噬，并建立細(xì)胞自噬

2、模型，同時(shí)觀察不同濃度的H2S是否有拮抗Hcy誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的作用。2、采用蛋白免疫印跡法（Western Bloting, WB）檢測(cè)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及受體（brain-derived neurotrophic factor，BDNF，Tyrosine kinase receptor B）蛋白的表達(dá)，觀察不同濃度的Hcy對(duì)BDNF蛋白和p-TrkB/TrkB蛋白比值的作用，同時(shí)檢測(cè) H2S是否能上調(diào) Hcy誘導(dǎo)自噬的 HT22細(xì)胞中

3、BDNF蛋白、p-TrkB/TrkB蛋白比值的表達(dá)。3、采用BDNF-TrkB抑制劑（k252a）預(yù)處理NaHS及Hcy共處理的HT22細(xì)胞，Western Blotting檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3II/I比值、P62、Beclin-1蛋白的表達(dá)確定抑制劑k252a是否可以逆轉(zhuǎn)H2S拮抗Hcy誘導(dǎo)HT22細(xì)胞自噬作用。
　　結(jié)果：1、Hcy誘導(dǎo)HT22細(xì)胞的自噬；Hcy（2.5、5、10 mmol/L）處理 HT22細(xì)胞24h后

4、電鏡檢測(cè)自噬泡的數(shù)量呈濃度依賴性增加， WB檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3II/I比值、Beclin-1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)濃度依賴性上調(diào)，P62蛋白表達(dá)呈現(xiàn)濃度依耐性下調(diào)，以上表明Hcy可以誘導(dǎo)HT22細(xì)胞自噬。2、H2S拮抗Hcy誘導(dǎo)HT22細(xì)胞自噬；NaHS（100、200、400μmol/L）可濃度依賴性抑制Hcy（5mmol/L，24 h）誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中自噬泡數(shù)量的增加和自噬相關(guān)蛋白LC3II/I比和Beclin-1蛋白的上調(diào)

5、、P62蛋白的下調(diào)，結(jié)果表明H2S可拮抗Hcy誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞自噬。3、H2S通過上調(diào)BDNF-TrkB通路拮抗Hcy誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞自噬；Hcy（2.5、5、10 mmol/L）處理HT22細(xì)胞24小時(shí)后檢測(cè)BDNF蛋白、p-TrkB/TrkB蛋白比值呈濃度依賴性下調(diào)，表明Hcy可以抑制HT22細(xì)胞BDNF蛋白、p-TrkB/TrkB蛋白比值的表達(dá)。NaHS（100、200、400μmol/L，24 h）處理HT22細(xì)胞后濃度依賴

6、性地上調(diào) BDNF蛋白、p-TrkB/TrkB蛋白比值的表達(dá)。予以 NaHS（400μmol/L）預(yù)處理HT22細(xì)胞半小時(shí)，然后加入Hcy（5mmol/L）共同處理24小時(shí)，H2S可以逆轉(zhuǎn)Hcy對(duì)HT22細(xì)胞BDNF蛋白表達(dá)的抑制和p-TrkB/TrkB蛋白比值的下調(diào)。予以K252a（10nmol/L）預(yù)處理NaHS、Hcy共處理的HT22細(xì)胞后，H2S拮抗Hcy誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞自噬的作用被部分阻斷，即相對(duì)于H2S保護(hù)組HT22細(xì)胞的