硫化氫上調(diào)SIRT1拮抗同型半胱氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激.pdf

1、【研究背景與目的】：
　　同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)具有神經(jīng)毒性，是老年性癡呆的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。我們以往的研究結(jié)果顯示硫化氫(Hydrogen sulfide, H2S)具有抗Hcy神經(jīng)毒性作用，但作用機(jī)制有待深入闡明。過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum, ER)應(yīng)激可導(dǎo)致神經(jīng)凋亡。沉默信息調(diào)節(jié)因子(Silent informationation regulator1,SIRT1)對(duì)神經(jīng)

2、保護(hù)具有重要的調(diào)節(jié)作用。我們推測(cè) H2S通過(guò)調(diào)控 SIRT1的表達(dá)拮抗 Hcy所致的ER應(yīng)激而發(fā)揮其抗Hcy神經(jīng)毒性作用。
　　為此，我們以Hcy損傷 PC12細(xì)胞為 Hcy神經(jīng)毒性的細(xì)胞模型，探討 H2S對(duì)Hcy誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ER應(yīng)激的拮抗作用以及SIRT1對(duì)H2S抗ER應(yīng)激和抗Hcy神經(jīng)毒性作用的介導(dǎo)效應(yīng)。
　　【方法】：
　　Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測(cè)PC12細(xì)胞存活率，碘化丙啶

3、(propidium iodide, PI)染色流式細(xì)胞儀(Flow cytometry,FCM)法檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡率，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)法檢測(cè)ER應(yīng)激相關(guān)蛋白(Glucose-regulated protein78,GRP78;Cleaved caspase-12,Cleaved caspase12)及SIRT1的表達(dá)情況。
　　【結(jié)果】：
　　1. Hcy可促進(jìn)PC12細(xì)胞ER應(yīng)激并下調(diào)PC12

4、細(xì)胞SIRT1表達(dá)
　　以1.25,2.5,5 mM的Hcy分別處理PC12細(xì)胞24 h后，PC12細(xì)胞內(nèi)GRP78、Cleaved caspase12表達(dá)呈濃度依賴性上升，提示Hcy可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ER應(yīng)激而發(fā)揮其神經(jīng)毒性。
　　以1.25,2.5,5 mM的Hcy分別處理PC12細(xì)胞24 h后，PC12細(xì)胞內(nèi)SIRT1的表達(dá)呈濃度依賴性下降，提示 Hcy誘導(dǎo) PC12細(xì)胞 ER應(yīng)激可能與其下調(diào) SIRT1的表達(dá)有關(guān)。<

5、br>　　2. H2S拮抗Hcy誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ER應(yīng)激
　　200和400μM的NaHS(H2S供體)合用5 mM的Hcy處理PC12細(xì)胞24 h后， PC12細(xì)胞內(nèi)GRP78和Cleaved caspase12的表達(dá)水平較Hcy(5 mM,24 h)單用時(shí)明顯下降，表明H2S可拮抗Hcy誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞ER應(yīng)激。
　　3. SIRT1介導(dǎo)H2S的抗Hcy誘導(dǎo)PC12細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和神經(jīng)毒性的作用
　　3.1 H2

6、S能上調(diào)PC12細(xì)胞SIRT1的表達(dá)
　　100、200和400μM的NaHS處理PC12細(xì)胞24 h，PC12細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平顯著增加，表明H2S能促進(jìn)PC12細(xì)胞高表達(dá)SIRT1。
　　3.2 H2S能減輕Hcy對(duì)SIRT1表達(dá)的抑制作用
　　400μM的NaHS合用5 mM的Hcy處理PC12細(xì)胞24 h后，Hcy對(duì)PC12細(xì)胞SIRT1表達(dá)的抑制作用明顯減輕。
　　3.3 Sirtinol(SIRT

7、1抑制劑)能阻斷H2S對(duì)Hcy誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ER應(yīng)激的拮抗作用
　　20nM的Sirtinol預(yù)處理PC12細(xì)胞2 h后，H2S對(duì)Hcy誘導(dǎo)PC12細(xì)胞GRP78和Cleaved caspase12表達(dá)的抑制作用被阻斷，表明H2S可通過(guò)上調(diào)SIRT1的表達(dá)拮抗Hcy誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ER應(yīng)激。
　　3.4Sirtinol(SIRT1抑制劑)能阻斷H2S對(duì)Hcy誘導(dǎo)PC12細(xì)胞毒性和凋亡的拮抗作用
　　20nM的Sirt