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文檔簡介
1、【研究背景與目的】:
甲醛(Formaldehyde, FA)具有神經(jīng)毒性作用。我們研究發(fā)現(xiàn)新型氣體信號分子硫化氫(Hydrogen sulfide, H2S)可拮抗甲醛的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用。但作用機(jī)理未闡明。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurophic factor, BDNF)是機(jī)體內(nèi)一種重要的神經(jīng)保護(hù)因子。乙醛脫氫酶-2(Aldehyde-dehydrogenase2, ALDH2)是機(jī)體重要的醛類代
2、謝酶。我們推測H2S可通過調(diào)節(jié)BDNF和/或ALDH2實(shí)現(xiàn)其抗甲醛神經(jīng)細(xì)胞毒性作用。
為此,我們以甲醛損傷 PC12細(xì)胞為甲醛神經(jīng)毒性的細(xì)胞模型,從 BDNF和ALDH2等方面探討H2S抗甲醛神經(jīng)細(xì)胞毒性的作用機(jī)制。
【方法】:
Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測PC12細(xì)胞活力;PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;NBT還原法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧累積水平;ALDH2活性試劑盒檢測PC12細(xì)
3、胞ALDH2活性;Western Blot檢測PC12細(xì)胞BDNF、ALDH2、Bax和Bcl-2的表達(dá);Elisa法檢測細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活力以及MDA和4-HNE的含量。
【結(jié)果】:
1. BDNF-TrkB通路介導(dǎo)H2S的抗甲醛損傷PC12細(xì)胞作用
1.1 H2S可上調(diào)PC12細(xì)胞BDNF的表達(dá)
100,200和400μM的NaHS處理PC12細(xì)胞24 h后,細(xì)胞BDNF的表達(dá)呈濃度依
4、賴性地上升;提前30 min加入200μM的H2S,可抑制 FA(120μM,24 h)對PC12細(xì)胞BDNF表達(dá)的下調(diào)作用,提示H2S的抗甲醛神經(jīng)毒性作用可能與其上調(diào)BDNF的表達(dá)相關(guān)。
1.2阻斷BDNF-TrkB通路可逆轉(zhuǎn)H2S對甲醛損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用
PC12細(xì)胞先提前給予BDNF-TrkB通路阻斷劑K252a(10 nM)處理30 min后,然后給予200μM H2S處理30 min,最后加入120
5、μM FA共處理細(xì)胞24 h。結(jié)果顯示K252a可逆轉(zhuǎn)H2S對甲醛降低PC12細(xì)胞活力的抑制作用、對甲醛誘導(dǎo)PC1細(xì)胞凋亡的拮抗作用和對甲醛促進(jìn)PC12細(xì)胞活性醛4-羥基壬烯醛(4-Hydroxy-2-nonenal,4-HNE)和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)以及活性氧(Reactive oxygen species, ROS)積累的抑制作用,還可逆轉(zhuǎn)H2S對甲醛下調(diào)PC12細(xì)胞Bcl-2表達(dá)和上調(diào)Bax表達(dá)的拮抗
6、作用和對甲醛激活caspase-3的降低作用。這些結(jié)果顯示K5252a阻斷BDNF受體TrkB可取消H2S的抗甲醛神經(jīng)細(xì)胞毒性作用。
上述結(jié)果表明BDNF-TrkB通路介導(dǎo)了H2S的抗甲醛神經(jīng)細(xì)胞毒性作用。
2. H2S可通過下調(diào)ALDH2拮抗甲醛損傷PC12細(xì)胞
2.1甲醛可上調(diào)PC12細(xì)胞ALDH2的表達(dá)和活性
60,120和240μM的FA處理 PC12細(xì)胞24 h后,細(xì)胞ALDH2的表達(dá)和
7、活性呈濃度依賴性地增加。
2.2抑制ALDH2的活性可拮抗甲醛對PC12細(xì)胞的損傷作用
PC12細(xì)胞用ALDH2抑制劑Dadzin(10μM)預(yù)處理30 min后,再加入甲醛(120μM)共處理24 h, Daidzin可減輕甲醛對細(xì)胞活力的抑制作用和對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用、可降低甲醛對PC12細(xì)胞 MDA、4-HNE和活性氧的累積作用,表明抑制ALDH2的表達(dá)和活性可拮抗甲醛神經(jīng)細(xì)胞毒性。
2.3 H2S可
8、抑制PC12細(xì)胞ALDH2的表達(dá)
100、200和400μM的NaHS處理PC12細(xì)胞24 h后,細(xì)胞ALDH2的表達(dá)則呈濃度依賴性下降。
2.4 H2S可抑制甲醛對PC12細(xì)胞ALDH2表達(dá)和活性的上調(diào)作用
PC12細(xì)胞經(jīng)H2S(200μM)預(yù)處理30 min,再合用FA(120μmol/L)24 h后,F(xiàn)A(120μM)對PC12細(xì)胞ALDH2表達(dá)和活性的上調(diào)作用明顯下降。
上述結(jié)果表明H2S
9、可通過下調(diào)ALDH2拮抗甲醛的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用。
3. BDNF-TrkB通路參與了H2S對PC12細(xì)胞ALDH2的下調(diào)作用
10 nM K252a(TrkB的阻斷劑)預(yù)處理PC12細(xì)胞30 min后加入200μM H2S,30 min后加入120μM的FA共處理細(xì)胞24 h,H2S對甲醛上調(diào)ALDH-2表達(dá)的抑制作用明顯減輕,表明 BDNF-TrkB通路參與了H2S對PC12細(xì)胞ALDH2的下調(diào)作用。
【
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