小G蛋白Rac1介導(dǎo)硫化氫促血管新生作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、硫化氫(H2S)是一種無色有臭雞蛋味的氣體，大量吸入會導(dǎo)致中毒。近年來，越來越多的研究表明，H2S成為繼一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之后的第三個氣體信號分子。內(nèi)源性H2S在機(jī)體的各個系統(tǒng)中都發(fā)揮著重要的作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，H2S可以增強(qiáng)NMDA受體的活性，易化長時程動作電位的產(chǎn)生，進(jìn)而對記憶過程產(chǎn)生影響;H2S可以通過清除氧自由基進(jìn)而發(fā)揮其保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。在心血管系統(tǒng)中，H2S能開放ATP敏感的鉀離子(KATP)通道，使血管平

2、滑肌舒張，降低血壓;體內(nèi)H2S生成減少與自發(fā)性高血壓的形成有密切關(guān)系，外源性給予H2S有顯著降壓效果，緩解高血壓的進(jìn)程;另外，H2S可以通過胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其心臟保護(hù)效應(yīng)來對抗心臟的缺血/再灌注損傷。在炎癥免疫系統(tǒng)中，既有H2S抗炎效應(yīng)的報(bào)道，也有H2S促炎效應(yīng)的報(bào)道。另外，在機(jī)體代謝方面，H2S可以顯著地降低機(jī)體的代謝率;H2S可以調(diào)節(jié)體內(nèi)胰島素的釋放。H2S甚至在延長機(jī)體壽命方面也發(fā)揮著其相應(yīng)的作用。
　　在血管新生方面，

3、我課題組于2007年在國際上首次發(fā)現(xiàn)H2S具有顯著的促血管新生效應(yīng)，該研究成果不僅在體外管腔形成實(shí)驗(yàn)，而且在小鼠Matrigel Plug動物模型上都得到了證實(shí)。隨后Szabo C等在雞胚絨毛膜尿囊（CAM）模型中也證實(shí)了H2S的促血管新生效應(yīng)。我課題組于2009年，在大鼠一側(cè)下肢缺血模型中再次證實(shí)，外源性H2S可以顯著地促進(jìn)大鼠缺血下肢的血管新生，該研究提示H2S在缺血下肢中的促血管新生效應(yīng)可能通過上調(diào)骨骼肌細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，進(jìn)而

4、作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGFR2受體而實(shí)現(xiàn)。AndreasPapapetropoulosa等的研究證實(shí)，內(nèi)源性產(chǎn)生的H2S是血管新生的促進(jìn)因子;他們利用雞胚絨毛膜尿囊(CAM)模型，給予內(nèi)源性H2S生成酶的抑制劑顯著地抑制了血管新生過程;另外，在主動脈環(huán)血管新生模型中，CSE基因敲除小鼠的主動脈環(huán)對VEGF的血管新生反應(yīng)顯著地低于野生型小鼠。他們的研究結(jié)果認(rèn)為，H2S的促血管新生效應(yīng)依賴于KATP channel-MAPK信號通路。然而

5、，H2S促血管新生作用的具體分子機(jī)制并不清楚。
　　血管新生與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移過程密切相關(guān)，其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移過程在血管新生過程中發(fā)揮了重要的作用。本研究以原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)為研究對象，主要針對H2S的促內(nèi)皮細(xì)胞的遷移效應(yīng)及其具體分子機(jī)制進(jìn)行研究，以期闡明H2S促血管新生的具體分子機(jī)制。
　　首先，我們研究了H

6、2S對HUVECs體外血管新生的作用。用細(xì)胞劃痕損傷模型和transwell跨膜遷移模型研究H2S對HUVECs遷移的影響，結(jié)果證實(shí)50μM的NaHS處理能顯著地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力;內(nèi)皮細(xì)胞體外管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，50μ M的NaHS顯著促進(jìn)HUVECs體外管腔的形成;用BrdU摻入法檢測H2S對HUVECs增殖的影響，結(jié)果顯示，50μM的NaHS顯著抑制HUVECs的細(xì)胞增殖。該結(jié)果提示，H2S的促HUVECs體外血管新生效應(yīng)主

7、要依賴于其促內(nèi)皮細(xì)胞遷移效應(yīng)。
　　其次，研究H2S對HUVECs肌動蛋白細(xì)胞骨架及細(xì)胞黏著斑的影響。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明，H2S使HUVECs肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)，以細(xì)胞前端片狀偽足生成增多為典型特征;H2S對HUVECs細(xì)胞paxillin-contained黏著斑的分布沒有顯著影響。Western Blot結(jié)果顯示，H2S對胞內(nèi)paxillin Tyr118和Ser126位的磷酸化沒有影響;但是H2S可以時間依賴性地促進(jìn)FA

8、K(Tyr576/577)位的磷酸化。這些結(jié)果表明，H2S使HUVECs肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)，這很可能是H2S促內(nèi)皮細(xì)胞遷移效應(yīng)的關(guān)鍵;另外，F(xiàn)AK的磷酸化也可能在H2S促內(nèi)皮細(xì)胞遷移效應(yīng)中發(fā)揮作用。
　　然后，研究H2S對小G蛋白Rho家族成員活性的影響。Pull-Down結(jié)果顯示，H2S可以一過性地活化小G蛋白Rac1，但對RhoA和Cdc42的活性沒有顯著影響;G-LISA結(jié)果再次證實(shí)了H2S對Rac1的一過性活化作用;Na

9、HS與人源性重組蛋白Rac1的細(xì)胞外直接反應(yīng)結(jié)果表明，H2S并不能直接活化Rac1，該結(jié)果提示，Rac1的活化是由胞內(nèi)上游信號分子的活化所介導(dǎo)的。
　　接著，研究Rac1是否介導(dǎo)了H2S所致的促內(nèi)皮細(xì)胞遷移效應(yīng)及促血管新生效應(yīng)。首先，成功地建立了內(nèi)皮細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染體系;針對Rac1基因，分別為內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染dominate negative Rac1質(zhì)粒及對Rac1基因進(jìn)行RNA干擾，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，Rac1介導(dǎo)了H2S所致的H

10、UVECs肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu);細(xì)胞劃痕損傷模型和transwell跨膜遷移模型結(jié)果顯示，Rac1介導(dǎo)了H2S所致的促HUVECs遷移效應(yīng);體外管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rac1介導(dǎo)了H2S所致的促HUVECs體外血管新生效應(yīng)。
　　再次，我們對H2S所致Rac1活化的上下游信號通路進(jìn)行了研究。應(yīng)用VEGFR的阻斷劑SU5416和PI3K的阻斷劑LY294002預(yù)處理，可以顯著地抑制H2S所致Rac1活化;細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，SU5

11、416和LY294002預(yù)處理，可以抑制H2S所致的HUVECs細(xì)胞片狀偽足的伸出;同時細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SU5416和LY294002預(yù)處理也顯著地抑制了H2S所致的促HUVECs細(xì)胞遷移效應(yīng)。這些結(jié)果表明，VEGFR-PI3K信號通路介導(dǎo)了H2S所致的Rac1活化;VEGFR-PI3K信號通路介導(dǎo)了H2S所致的HUVECs細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu);VEGFR-PI3K信號通路介導(dǎo)了H2S所致的促HUVECs細(xì)胞遷移效應(yīng)。轉(zhuǎn)染do

12、minant negativeAkt后，H2S所致的Rac1活化并不能被抑制，說明H2S所致的Rac1活化并不依賴于Akt的活化。另外，激酶抑制劑研究結(jié)果表明，ERK獨(dú)立于VEGFR-PI3K信號通路，也在H2S所致的促HUVECs遷移效應(yīng)中發(fā)揮著一定的作用。轉(zhuǎn)染dominant negative Rac1質(zhì)粒及Rac1 SiRNA后，H2S所致的cofilin Ser3位的磷酸化被顯著抑制，說明cofilin是Rac1的下游效應(yīng)分子;

13、cofilin作為肌動蛋白結(jié)合蛋白很可能直接調(diào)控了H2S所致的內(nèi)皮細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)。
　　最后，檢測CSE和CBS在HUVECs內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)及在大鼠胸主動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞層的表達(dá)與分布。RT-PCR結(jié)果顯示，在基因水平上，HUVECs內(nèi)皮細(xì)胞既表達(dá)CSE又表達(dá)CBS; Real-Time PCR結(jié)果表明，mRNA水平上CBS的表達(dá)遠(yuǎn)高于CSE，大約是CSE基因水平的64倍之多;Western Blot結(jié)果顯示，在蛋白質(zhì)水

14、平上，HUVECs內(nèi)皮細(xì)胞既表達(dá)CSE同時也表達(dá)CBS;免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，大鼠胸主動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞層不僅有CSE的表達(dá)，而且也有CBS的高表達(dá)。這些結(jié)果說明，在動脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞層，不僅有CSE的表達(dá)，而且同時有CBS的表達(dá)。這為研究內(nèi)源性H2S在心血管系統(tǒng)中的作用打下了一定基礎(chǔ)。
　　總之，我們的研究首次證實(shí)了:①小G蛋白Rac1介導(dǎo)了H2S的體外促血管新生效應(yīng)，該效應(yīng)的發(fā)揮主要是通過肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)所致的內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力