硫化氫促血管新生機制研究——硫化氫靶分子VEGFR2的發(fā)現(xiàn).pdf

1、硫化氫(Hydrogen Sulfide，H2S)是一種有臭雞蛋味的無色氣體，大量吸入可致中毒，過去一直被認(rèn)為是毒性氣體。但是，從上世紀(jì)90年代開始，人們對硫化氫這種氣體物質(zhì)有了新的認(rèn)識。1989年，科學(xué)家在大鼠和人腦中檢測到了內(nèi)源性的H2S，提示H2S可能具有一定的生理作用。近年來不斷有研究發(fā)現(xiàn)多種哺乳動物細(xì)胞自身能產(chǎn)生H2S，在正常大鼠的血液中H2S濃度達到46μ mol/L，在腦中H2S濃度高達100μmol/L。內(nèi)源性H2S主要

2、由胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionineγ-lyase，CSE)或胱硫醚-β-合酶(Cystathionineβ-synthase，CBS)分解L-半胱氨酸產(chǎn)生。CSE主要存在于心血管系統(tǒng)中，CBS主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)中。內(nèi)源性H2S對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)均有重要的生理調(diào)節(jié)功能。另外，H2S是一種小分子量的氣體分子，能穿透細(xì)胞膜直接起效，在體內(nèi)產(chǎn)生且受內(nèi)源性關(guān)鍵酶的調(diào)控。因此，近些年來，人們對H2S不斷加以重視

3、，將其定位于包括一氧化氮、一氧化碳在內(nèi)的氣體信號分子家族，是第三個氣體信號分子。
　　在心血管系統(tǒng)，H2S通過興奮KATP通道，增加KATP通道電流，使細(xì)胞膜出現(xiàn)超極化而使血管平滑肌舒張，降低血壓;H2S可抑制平滑肌細(xì)胞異常增殖，并促進其凋亡，緩解血管結(jié)構(gòu)重構(gòu);另外，H2S對心臟有負(fù)性肌力作用，并能減輕缺血再灌注引起的心肌損傷。本課題組于2007年首次研究發(fā)現(xiàn)，H2S能夠促進血管新生，該結(jié)果不僅在恒河猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞株RF

4、/6A上，而且在C57小鼠Matrigel plug模型上得到證實。2009年本課題組在大鼠單側(cè)后肢缺血模型中，又進一步證實，H2S能夠促進大鼠缺血下肢的血管新生。另外，H2S的促血管新生的效應(yīng)在雞胚絨毛膜尿囊CAM模型中得到證實。
　　血管新生是指在原有血管基礎(chǔ)上長出新的毛細(xì)血管，其過程包括血管外基質(zhì)降解，內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移形成子代血管支。這一現(xiàn)象可發(fā)生于胚胎發(fā)育、組織器官生長、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移、糖尿病等多種生理、病理

5、過程中。在血管新生過程中，多種生長因子起到促進/抑制調(diào)控作用，其中，血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)作為促進因子，其激活血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2，VEGFR-2)產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)是血管新生過程中最核心的信號通路，能夠促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖和遷移。
　　血管新生與血管內(nèi)

6、皮細(xì)胞的增殖和遷移有密切關(guān)聯(lián)，其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移過程在血管新生中起著重要的作用。本課題組前期研究結(jié)果顯示，H2S在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞有促進體外血管新生的作用。NaSH儀在低濃度（10μmol/L）能夠促進細(xì)胞增殖;而NaSH在30-200μmol/L都能顯著促進細(xì)胞遷移和體外管腔形成。并且，H2S促進血管新生的作用不依賴于VEGF的表達變化，但是依賴于VEGFR-2/PI3K/Akt信號通路。另外，H2S與重組蛋白VEGFR-2

7、的直接反應(yīng)結(jié)果顯示H2S可以直接提高VEGFR-2的活性，但對PI3K/Akt的活性沒有影響。這就提示，H2S在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的靶分子是VEGFR-2。因此，本課題以VEGFR-2為研究對象，主要針對H2S激活VEGFR-2的具體機制進行研究，以闡明H2S促進血管新生的具體機制。
　　首先，我們進一步研究了H2S對VEGFR-2的作用。VEGFR-2中含有多個酪氨酸磷酸化位點:Tyr951、Tyr996、Tyr1054、Tyr10

8、59、Tyr1175以及Tyr1214。實驗結(jié)果顯示，VEGF(10ng/ml)可以顯著提高所有磷酸化位點的磷酸化水平，而NaSH(50μmol/L)儀對Tyr1175位點的磷酸化水平有提高作用，這提示，H2S對VEGFR-2的激活很可能不同于其經(jīng)典激活劑VEGF的激活方式。用siRNA將VEGFR-2的基因沉默以后，Western Blot檢測結(jié)果顯示，VEGFR-2蛋白表達水平降低，說明基因沉默體系建立成功;而且與轉(zhuǎn)染了陰性對照的細(xì)

9、胞相比，H2S在轉(zhuǎn)染VEGFR-2 siRNA的內(nèi)皮細(xì)胞上的促細(xì)胞遷移作用下降。這進一步說明，VEGFR-2在H2S促進內(nèi)皮細(xì)胞遷移過程中起著至關(guān)重要的作用。另外，我們分別比加入H2S提前0.5小時和24小時向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加VEGF的中和抗體anti-VEGF，觀察到提前0.5小時加入anti-VEGF不能阻斷H2S的促進細(xì)胞遷移作用;而提前24小時加入anti-VEGF卻能阻斷H2S的促進細(xì)胞遷移作用。這個結(jié)果提示，H2S激活VEG

10、FR-2進而促進血管新生的作用需要基礎(chǔ)水平VEGF的作用。
　　其次，我們對VEGFR-2重組蛋白進行酶解之后的質(zhì)譜檢測分析，結(jié)果顯示，VEGFR-2中Cys1045與Cys1024之間存在一個二硫鍵，當(dāng)NaSH處理之后，這個二硫鍵被打斷，而且沒有發(fā)現(xiàn)任何其他形式的修飾。之后我們合成了VEGFR-2中主要功能片段的多肽，以及用二硫鍵連接的Cys1045-Cys1024模擬六肽，用NaSH與功能肽段、模擬六肽、20種基本氨基酸和胱氨

11、酸進行直接反應(yīng)后用ESI-MS進行質(zhì)譜檢測分析，分析結(jié)果顯示，NaSH對功能肽段和20種基本氨基酸都沒有任何修飾作用，但是可以打斷模擬六肽和胱氨酸中的二硫鍵。這些結(jié)果證實，NaSH對VEGFR-2的直接作用很可能僅僅是打斷了該受體中的二硫鍵，而沒有產(chǎn)生任何其他的修飾作用。為了進一步證實VEGFR-2中Cys1045與Cys1024之間的二硫鍵是NaSH作用的靶點，我們將Cys1045位突變?yōu)楸彼?Ala)，阻止Cys1045與Cys1

12、024之間形成二硫鍵。突變之后的VEGFR-2其激酶活性提高，而且H2S不能再直接激活突變體VEGFR-2(C1045A)。為進一步驗證VEGFR-2中Cys1045與Cys1024之間的二硫鍵是H2S促內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用靶點，我們用慢病毒載體將突變的VEGFR-2(C1045A)轉(zhuǎn)染入HUVECs并使其表達。在劃痕損傷實驗中，與轉(zhuǎn)染了對照空質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染VEGFR-2(C1045A)的HUVECs，其細(xì)胞遷移作用明顯增強。雖然在

13、轉(zhuǎn)染了對照質(zhì)粒的細(xì)胞中，H2S仍有促遷移作用，但轉(zhuǎn)染了突變VEGFR-2(C1045A)的細(xì)胞，H2S的促遷移作用被取消。這些數(shù)據(jù)不僅表明，Cys1045-Cys1024二硫鍵作為一種抑制序列發(fā)揮作用，也證明作為VEGFR-2介導(dǎo)的H2S促進內(nèi)皮細(xì)胞遷移的靶結(jié)構(gòu)，Cys1045-Cys1024二硫鍵發(fā)揮著復(fù)雜作用。另外，我們還測定了遷移與未遷移的血管內(nèi)皮細(xì)胞中的活性氧(ROS)水平。定量分析表明，與未遷移的細(xì)胞相比，遷移的細(xì)胞內(nèi)ROS水

14、平明顯增加，這表明在細(xì)胞遷移過程中可能會出現(xiàn)一個短暫的細(xì)胞內(nèi)氧化環(huán)境;而免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，在遷移過程中的細(xì)胞，ROS與VEGFR-2共定位，這進一步表明在細(xì)胞遷移過程中，VEGFR-2處于一個短暫的細(xì)胞內(nèi)氧化環(huán)境。
　　然后，我們探討了H2S打斷二硫鍵的作用機制，并對H2S發(fā)揮作用的主要形式作初步的探索。用與NaSH相同氧化還原能力的維生素C處理胱氨酸，ESI-MS檢測分析顯示，維生素C不能打斷胱氨酸的二硫鍵，這提示，NaSH

15、打斷二硫鍵的作用不完全是因為其還原能力。H2S在水溶液中通常以H2S氣體和HS-離子兩種形式存在。pH值越高，HS-離子形式越多;pH值越低，H2S氣體形式越多。我們在不同pH條件下進行NaSH與胱氨酸或者模擬六肽的直接反應(yīng)。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)體系pH≤5.5時，NaSH將不再能夠打開胱氨酸或者六肽之間的二硫鍵。這提示，很可能是HS-在發(fā)揮打斷二硫鍵的作用。在研究H2S和胱氨酸直接反應(yīng)的過程中，我們還找到了中間產(chǎn)物Cys-SSH，推測H2

16、S打斷二硫鍵的過程是一個以HS-作為親核集團攻擊二硫鍵的兩步反應(yīng)。而且這個推測也用量子化學(xué)計算得到證實，這對我們深入了解H2S打斷二硫鍵的具體機制提供了實驗依據(jù)。
　　最后，檢測產(chǎn)生內(nèi)源性H2S的酶CSE和CBS在HUVECs上的表達與分布。免疫熒光染色結(jié)果顯示，HUVECs不僅有CSE表達，而且同時有CBS表達。CSE主要分布在靠近細(xì)胞膜的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，CBS則主要分布于胞漿。而且，免疫熒光雙標(biāo)染色顯示，在HUVECs，CSE和C

17、BS都與VEGFR-2共定位，這提示在VEGFR-2存在的情況下，這些內(nèi)皮細(xì)胞能產(chǎn)生內(nèi)源性H2S。這為研究內(nèi)源性H2S與VEGFR-2的作用及內(nèi)源性H2S在心血管系統(tǒng)的作用打下了一定的基礎(chǔ)。
　　總之，我們深入研究了H2S促進內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的機制，特別是深入研究了H2S究竟如何激活其在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的靶分子VEGFR-2。首次證實:①VEGFR-2的Cys1045與Cys1024之間存在二硫鍵;②該二硫鍵是H2S作用于VEGFR