cTnI抗體結(jié)合心肌細(xì)胞膜α-enolase激活PTEN-Akt信號(hào)通路致心功能損害.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 研究目標(biāo)為跟蹤評(píng)價(jià)AMI患者中cTnⅠAAb和左室重構(gòu)之間的關(guān)系，并獲取發(fā)生左室重構(gòu)的cTnⅠAAb陽(yáng)性AMI患者血清，以期得到最可能導(dǎo)致AMI患者心臟左室重構(gòu)的cTnⅠAAb，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究cTnⅠAAb的功能奠定基礎(chǔ)。在本研究中有131名AMI患者納入研究。患者血清樣本全部采用間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)cTnⅠAAb，患者在入院和出院1年左右檢測(cè)超聲心動(dòng)圖評(píng)估左室重構(gòu)。結(jié)果顯示，1

2、31名AMI患者中cTnⅠAAb陽(yáng)性率為17.56％(23/131)。131名AMI患者中有90人[19（cTnⅠAAb陽(yáng)性）VS79（cTnⅠAAb陰性））跟蹤到了心臟超聲波數(shù)據(jù)，且19名AMI患者發(fā)生了左室重構(gòu)。經(jīng)過(guò)兩分類(lèi)Logistic回歸分析，有2個(gè)變量為AMI患者左室重構(gòu)的潛在危險(xiǎn)因素，分別是BNP峰值(OR:1.001，95％CI:1.000-1.002，p:0.028)、cTnⅠAAb(OR:3.552，95％CI:1.1

3、48-10.989，p:0.028)。19名發(fā)生了左室重構(gòu)的AMI患者中有10名cTnⅠAAb陽(yáng)性和9名cTnⅠAAb陰性。這10名發(fā)生了左室重構(gòu)的cTnⅠAAb陽(yáng)性患者血清，可供后續(xù)研究使用。
　　第二部分 研究目標(biāo)為從第一部分研究中獲得的cTnⅠAAb陽(yáng)性AMI患者血清中純化出cTnⅠAAb，并證實(shí)其可與cTnⅠ特異性結(jié)合。在本部分實(shí)驗(yàn)中我們首次報(bào)道:從cTnⅠAAb陽(yáng)性AMI患者中獲得了約36ml患者血清，并成功地純化出2.

4、24mg(0.8ml，2.8mg/ml)cTnⅠAAb。采用SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色分離該純化蛋白的條帶主要在20KD和50KD附近，與免疫球蛋白相吻合;采用間接免疫熒光、間接免疫組化和Western Blotting技術(shù)證實(shí)，純化的cTnⅠAAb可以特異性識(shí)別人、大鼠、小鼠心肌組織中cTnⅠ，還可與大鼠乳鼠心肌細(xì)胞膜的某個(gè)蛋白相結(jié)合。由于本部分研究獲得的cTnⅠAAb是從10名cTnⅠAAb陽(yáng)性且發(fā)生左室重構(gòu)的AMI患者血清中

5、提取的，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道cTnⅠAAb與AMI預(yù)后差和心功能障礙有關(guān)，我們推測(cè)純化的cTnⅠAAb也與這些患者LEDV明顯增加有關(guān)，是具有致病理作用的。但是這需要更明確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)加以證實(shí)。
　　第三部分 研究目標(biāo)為采用體外實(shí)驗(yàn)的策略，模擬cTnⅠAA與心肌細(xì)胞直接接觸的微環(huán)境，重點(diǎn)研究純化的人cTnⅠAAb與原代SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后，心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大、凋亡和自噬狀態(tài)的變化，以驗(yàn)證我們的科學(xué)假設(shè)。本部分研究結(jié)果顯示:將cTnⅠA

6、Ab與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)12h后，出現(xiàn)了自噬相關(guān)基因Atg5和Beclin-1mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1表達(dá)亦增高，而在24h后這些基因和蛋白的表達(dá)都顯著下調(diào)。心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)則在與cTnⅠAAb共培養(yǎng)24h后開(kāi)始出現(xiàn)變化，48h則更為明顯;隨共培養(yǎng)時(shí)間增加促凋亡蛋白Bax表達(dá)逐漸增加，抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)則逐漸減少。整個(gè)過(guò)程中，心肌細(xì)胞出現(xiàn)自噬和凋亡此消彼長(zhǎng)的平衡關(guān)系;同批

7、實(shí)驗(yàn)、相同劑量的cTnTpAb對(duì)照和人IgG對(duì)照則無(wú)這些變化。但是在本部分實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有觀察到cTnⅠAAb與原代大鼠乳鼠心肌細(xì)胞共孵育后致使心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大改變。從這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到提示:加入cTnⅠAAb對(duì)于培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞是一種有害的刺激因素，心肌細(xì)胞首先表現(xiàn)出與自噬激活相關(guān)的基因mRNA和這些基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，自噬激活進(jìn)行自我保護(hù);當(dāng)有害刺激因素持續(xù)存在的情況下，自噬的激活逐漸減弱，細(xì)胞的凋亡開(kāi)始增加，但是并未出現(xiàn)代償性心

8、肌細(xì)胞肥大或肥大的趨勢(shì)。
　　第四部分 研究目標(biāo)為克服從患者血清中獲得的人cTnⅠAAb量有限的困難，選擇一株能替代cTnⅠAAb的cTnⅠmAb完成后續(xù)研究。明確實(shí)驗(yàn)室自制的3株cTnⅠmAb（cTnⅠmAb N1，cTnⅠmAb N2，cTnⅠmAb N3）所針對(duì)cTnⅠ的抗原位點(diǎn)位于何部位，其針對(duì)的抗原位點(diǎn)是否為人cTnⅠAAb所針對(duì)的主要cTrⅠ抗原位點(diǎn)之一，能否與心肌細(xì)胞膜呈現(xiàn)結(jié)合，以及結(jié)合的細(xì)胞膜靶抗原是什么。本部分研

9、究結(jié)果顯示:采用抗原位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)cTnⅠmAb N1可以與cTnⅠAAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合BCG823和原代乳鼠心肌細(xì)胞膜，致使cTnⅠAAb與心肌細(xì)胞膜的結(jié)合率顯著下降，并首次證實(shí)cTnⅠAAb針對(duì)的抗原位點(diǎn)主要為cTnⅠN端a.a.r.26-49，是cTnⅠAAb針對(duì)的抗原位點(diǎn)中最主要的、且比例高的之一;采用cTnⅠmAbN1耦聯(lián)的親和層析柱純化出異常表達(dá)在BCG823細(xì)胞中與之結(jié)合的蛋白分子，并通過(guò)飛行質(zhì)譜技術(shù)、免疫共沉淀和We

10、stem Blotting技術(shù)等，首次明確證實(shí)該蛋白分子為α-enolase(ENO1)，而不是cTnⅠ，且cTnⅠmAbN1可以與天然狀態(tài)的α-enolase發(fā)生特異性結(jié)合。
　　第五部分 研究目標(biāo)為明確cTnⅠmAb N1能否重現(xiàn)cTnⅠAAb致心肌細(xì)胞病理變化作用？既然cTnⅠmAb可以識(shí)別心肌細(xì)胞膜表達(dá)的ENO1，cTnⅠmAb與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后，ENO1的表達(dá)發(fā)生了什么變化？這些變化是否與心肌細(xì)胞的病理改變相關(guān)？本部分研

11、究結(jié)果顯示:我們成功地將cTnⅠmAb N1替代了從AMI患者血清中提取的cTnⅠAAb，在原代大鼠乳鼠心肌細(xì)胞誘導(dǎo)出濃度依賴(lài)的和時(shí)間依賴(lài)的凋亡應(yīng)答。同時(shí)，在cTnⅠmAbN1刺激心肌細(xì)胞的過(guò)程中，ENO1的表達(dá)明顯升高;采用ENO1-si-RNA抑制ENO1表達(dá)后，可以抵抗cTnⅠmAbN1刺激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡;而等濃度的小鼠IgG對(duì)照、cTnTmAb4T19抗體對(duì)照及Negative-siRNA對(duì)照均無(wú)此現(xiàn)象。本部分研究結(jié)果提示我

12、們，AMI血清中的cTnⅠAAb與心肌細(xì)胞作用所引起的心肌細(xì)胞凋亡損害，不僅與cTnⅠAAb中與心肌細(xì)胞膜結(jié)合的抗原位點(diǎn)是否占優(yōu)勢(shì)地位有關(guān)，也與cTnⅠAAb在患者循環(huán)中的濃度和持續(xù)的時(shí)間有關(guān)。
　　第六部分 研究目標(biāo)為使用cTnⅠmAb N1替代cTnⅠAAb，嘗試在動(dòng)物體內(nèi)引起心臟功能障礙和心肌組織的病理改變，并研究其相關(guān)的信號(hào)通路，旨在能夠較確切地闡明cTnⅠAAb或cTnⅠmAb N1致心肌損傷的作用和機(jī)制，以解釋臨床中所

13、發(fā)現(xiàn)的部分cTnⅠAAb陽(yáng)性患者出現(xiàn)不良臨床轉(zhuǎn)歸的可能原因，希望本部分的研究結(jié)果能豐富自身免疫性心臟疾病免疫病理?yè)p傷的發(fā)生機(jī)制，有助于尋找預(yù)防和治療AMI后心室重構(gòu)的新靶標(biāo)和新策略。本部分結(jié)果顯示:采用cTnⅠmAbN1可成功誘導(dǎo)Balb/c小鼠心臟收縮功能障礙，HE染色、masson染色和Tunel染色結(jié)果顯示，小鼠心肌組織心肌膠原沉積增加、心外膜鈣化斑塊形成和心肌細(xì)胞凋亡輕度增加，而心臟外形和心肌組織細(xì)胞大小未見(jiàn)增加，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與

14、第三部分實(shí)驗(yàn)中cTnⅠAAb作用的原代乳鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡增加，而未出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大的研究結(jié)果互相印證;采用CD3、CD8、CD4、CD20、CD68對(duì)模型小鼠心肌組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，未見(jiàn)這些免疫分子表達(dá)，表明注射cTnⅠmAb N1的Ⅰ組小鼠心臟出現(xiàn)的功能和病理改變主要是代償性的，而非炎性的;采用PathScan Akt Signaling Antibody Array蛋白芯片對(duì)小鼠心肌組織Akt通路16個(gè)主要磷酸化蛋白位點(diǎn)進(jìn)行

15、篩查，發(fā)現(xiàn)注射cTnⅠmAbN1的Ⅰ組小鼠心臟組織出現(xiàn)了第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted onchromosome ten，PTEN)Ser380上調(diào)和蛋白激酶B(protein kinases B，Akt)Thr308下調(diào)，而既有文獻(xiàn)證實(shí)PTEN缺失與心肌細(xì)胞肥大相關(guān)，這與前期心肌細(xì)胞肥大陰性的結(jié)果相互印證;當(dāng)用cTnⅠmAb N1與原代心肌細(xì)胞共

16、培養(yǎng)后，也出現(xiàn)了同樣的信號(hào)分子改變，在原代心肌細(xì)胞中采用si-RNA沉默心肌細(xì)胞內(nèi)的ENO1后，PTEN-Akt信號(hào)通路激活的現(xiàn)象減弱，與前期沉默心肌細(xì)胞ENO1后心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象得到緩解相互呼應(yīng)。
　　總之，通過(guò)這六部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們首次明確證實(shí)，cTnⅠAAb不僅是AMI患者發(fā)生心肌損傷后心室重構(gòu)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，而且從發(fā)生左室重構(gòu)的cTnⅠAAb陽(yáng)性AMI患者血清中純化得到的cTrⅠAAb中，針對(duì)cTnⅠ的N端a.a.r

17、.26-49位的cTnⅠmAb N1是其主要組成部分。該cTnⅠmAb N1可以通過(guò)與心肌細(xì)胞膜的α-enolase發(fā)生交叉反應(yīng)而結(jié)合在心肌細(xì)胞膜上，引起心肌細(xì)胞α-enolase表達(dá)升高、PTEN-Akt信號(hào)通路激活，PTEN Ser380磷酸化增強(qiáng)，Akt Thr308位磷酸化減弱，最后引起的心肌細(xì)胞的改變并不是細(xì)胞肥大，而是導(dǎo)致了心肌細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性的凋亡增加;當(dāng)采用si-RNA技術(shù)沉默心肌細(xì)胞的α-enolase，