AKAP95和Cx43蛋白共同調(diào)控細(xì)胞G1-S期轉(zhuǎn)換的機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為兩部分，第一部分采用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括肺癌組織中AKAP95和Cyclin D3、Akt蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系及3種蛋白之間的關(guān)聯(lián)性分析、直腸癌組織中AKAP95、CyclinD1、Cyclin E1和Cx43蛋白的關(guān)聯(lián)性分析。通過(guò)檢測(cè)51例肺癌組織和15例癌旁組織中細(xì)胞周期蛋白D3(CyclinD3)、蛋白激酶A錨定蛋白95(AKAP95)和絲/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，Akt，

2、亦稱蛋白激酶B，PKB)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，AKAP95、Cyclin D3和Akt蛋白在肺癌組織中呈高表達(dá)，均高于癌旁組織，提示三者在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用;CyclinD3蛋白的表達(dá)與肺癌組織的有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型和分化程度均無(wú)關(guān)，Akt蛋白表達(dá)與肺癌組織的分化程度有關(guān);AKAP95蛋白和Cyclin D3蛋白表達(dá)，以及AKAP95蛋白和Akt蛋白表達(dá)呈關(guān)聯(lián)性;Cyelin D3與Akt蛋白表達(dá)之間在肺癌組織中未見(jiàn)關(guān)聯(lián)性。同樣采用免疫

3、組化方法檢測(cè)50例直腸癌組織和16例癌旁組織中AKAP95、細(xì)胞周期蛋白E1(Cyclin E1)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)以及間隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，AKAP95、Cyclin E1和Cyclin D1蛋白在直腸癌組織與癌旁組織相比均呈高表達(dá)，提示三者可能與直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān);AKAP95和Cylin E1蛋白、Cyclin E1和CyclinD1蛋白、CyclinE1.和Cx43蛋

4、白，以及Cyclin D1和Cx43蛋白之間在直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能有協(xié)同作用。另外在直腸癌組織中，AKAP95、Cyclin E1、Cyclin D1和Cx43蛋白的表達(dá)在不同的分化程度、組織學(xué)類型、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)指標(biāo)均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　第二部分為細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，選取肺腺癌細(xì)胞A549作為研究對(duì)象，將pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-RNAi-Cx43、pcDNA3.1(+)-Cx43、pcDNA3.

5、1(+)-AKAP95、pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-RNAi-AKAP95質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到肺腺癌A549細(xì)胞中，Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及分析與Cx43、AKAP95的關(guān)系。結(jié)果顯示:1.AKAP95蛋白表達(dá)升高時(shí)Cyclin E1和CyclinD1蛋白表達(dá)上升，CDK4表達(dá)降低，CDK2表達(dá)略微降低，并能抑制Cyclin D1蛋白位點(diǎn)Thr286的磷酸化，卻能提高CDK2活性，提示AKAP95蛋

6、白能抑制Cyclin D1蛋白的降解，并可以通過(guò)提高Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表達(dá)以及提高CDK2活性，從G1期早期開始到G1/S期發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的作用;Cx43蛋白表達(dá)升高時(shí)Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表達(dá)下降，CDK4、CDK2表達(dá)提高，并能促進(jìn)Cyclin D1蛋白位點(diǎn)Thr286的磷酸化，而CDK2活性受到抑制，提示Cx43蛋白能促進(jìn)Cylin D1蛋白的降解，并可以通過(guò)降低Cyclin D1

7、和Cyclin E1蛋白以及抑制CDK2活性，從G1期早期開始到G1/S期發(fā)揮抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的作用。2.AKAP95蛋白能促進(jìn)Rb蛋白的表達(dá)，并可以促進(jìn)位點(diǎn)Ser780和Ser795的磷酸化，對(duì)位點(diǎn)Ser567的磷酸化未見(jiàn)影響;Cx43蛋白能抑制Rb蛋白的表達(dá)，并可以抑制位點(diǎn)Ser780、Ser795和Ser567的磷酸化。提示AKAP95蛋白能促進(jìn)Rb蛋白表達(dá)，并能促進(jìn)Rb蛋白早期Ser795和中期Ser780位點(diǎn)的磷酸化，但并不能

8、通過(guò)磷酸化Ser567位點(diǎn)的來(lái)促進(jìn)Rb蛋白的完全活化;Cx43蛋白能抑制Rb蛋白表達(dá)，并能抑制Ser795、Ser780和Ser567位點(diǎn)的磷酸化，在整個(gè)Rb蛋白磷酸化過(guò)程中均起到抑制作用。3.除了對(duì)Rb蛋白Ser567位點(diǎn)的磷酸化作用不同，AKAP95和Cx43蛋白對(duì)上述蛋白呈現(xiàn)相反作用，并且AKAP95和Cx43質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明共轉(zhuǎn)染時(shí)AKAP95和Cx43蛋白對(duì)上述蛋白的作用是單獨(dú)轉(zhuǎn)染作用的疊加，而細(xì)胞G1期到有絲分裂中期A

9、KAP95和Cx43蛋白處于結(jié)合狀態(tài)，提示AKAP95和Cx43蛋白通過(guò)AKAP95-Cx43復(fù)合物的作用共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。4.AKAP95蛋白能抑制Akt蛋白表達(dá)，并能通過(guò)抑制Akt位點(diǎn)Ser473的磷酸化來(lái)抑制Akt蛋白的完全活化;而Cx43蛋白能促進(jìn)Akt蛋白表達(dá)，并能促進(jìn)位點(diǎn)Ser473磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)Akt蛋白的完全活化。結(jié)合之前的研究Akt能促進(jìn)Cx43蛋白的磷酸化而抑制Cx43蛋白活性、提高細(xì)胞進(jìn)程，以及G1末期到有絲