低氧后G1-S期增殖型HKC抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的研究.pdf

1、腎功能衰竭是各種急慢性腎臟損害所致一種臨床危重癥，腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化是其發(fā)生以及進(jìn)行性惡化的主要危險(xiǎn)因素之一，而腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與非適應(yīng)性腎小管重塑密切相關(guān)。如能闡明腎小管重塑的過程及損傷后再生修復(fù)機(jī)制，則可采取相應(yīng)干預(yù)措施，防止腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化的發(fā)生，為進(jìn)一步預(yù)防腎功能衰竭的發(fā)生奠定基礎(chǔ)。 生長(zhǎng)發(fā)育中的腎臟，受細(xì)胞周期循環(huán)調(diào)控而進(jìn)行細(xì)胞發(fā)展方向的“篩選”。 增殖、凋亡、增生和分化細(xì)胞群常常共存于

2、正常的腎小管細(xì)胞群體中，在正常生長(zhǎng)條件下通過以增殖細(xì)胞為多數(shù)比例的動(dòng)態(tài)平衡來保證腎小管正常的生長(zhǎng)發(fā)育。G1/S 期的“篩選”功能，被認(rèn)為是細(xì)胞周期循環(huán)中最重要的環(huán)節(jié)。成熟腎小管上皮細(xì)胞（RTEs）在生理狀態(tài)下，很少逆轉(zhuǎn)入胚胎發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞周期行為，但在病理性損傷時(shí)，RTEs 則發(fā)生類胚胎發(fā)育的損傷后再修復(fù)過程。 在缺血缺氧性腎小管損傷早期，低氧損傷具有細(xì)胞“同步化”作用，誘導(dǎo)分化狀態(tài)的RTEs 進(jìn)入細(xì)胞周期，并停滯在G1/S 期

3、，進(jìn)行增殖或凋亡的“篩選”，使那些“健康存活”的RTEs 通過啟動(dòng)S 期脫氧核糖核酸（DNA）合成而進(jìn)入細(xì)胞增殖周期。因此，我們推斷低氧等病理損傷后受G1/S 期所“篩選”的增殖RTEs 具有在“率領(lǐng)”整個(gè)腎小管組織細(xì)胞群體定向啟動(dòng)適應(yīng)性再生修復(fù)的過程中，勢(shì)必會(huì)同時(shí)抑制成纖維細(xì)胞（Fb）的增殖。為此，本研究通過模擬受低氧干預(yù)的停留在G1/S 期的即將發(fā)生增殖的RTEs 與Fb 共同培養(yǎng)，研究增殖型G1/S 期RTEs 對(duì)Fb 的抑制作用

4、，以驗(yàn)證我們的論點(diǎn)。為進(jìn)一步研究G1/S期HKC 啟動(dòng)成熟腎小管損傷后再生修復(fù)機(jī)制以及臨床早期干預(yù)非適應(yīng)性腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化所致的腎功能衰竭奠定基礎(chǔ)。 【目的】 本研究通過模擬受低氧干預(yù)的停留在G1/S 期的即將發(fā)生增殖的RTEs 與Fb 共同培養(yǎng)，研究增殖型G1/S 期RTEs 對(duì)Fb 的生長(zhǎng)抑制作用，以論證低氧損傷后G1/S 期所“篩選”的增殖RTEs 具有“率領(lǐng)”整個(gè)腎小管細(xì)胞群體抑制成纖維細(xì)胞（Fb）的增殖

5、，進(jìn)而定向啟動(dòng)適應(yīng)性再生修復(fù)的作用。 【方法】 1、建立人腎小管上皮細(xì)胞系（HKC）無血清饑餓法同步化的方法采用血清饑餓的同步化方法，探討將HKC 同步化于G0/G1 期時(shí)最佳的同步化時(shí)間和胎牛血清濃度，并通過流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞免疫化學(xué)方法驗(yàn)證同步化結(jié)果。 2、建立低氧條件下HKC發(fā)生G1/S期阻滯的方法分別在低氧與正常氧條件下培養(yǎng)同步化于G0/G1 期的HKC，采用過流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞免疫化學(xué)、Western bl

6、ot 及電鏡方法探討低氧對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的干預(yù)作用。 3、探討增殖型G1/S期HKC對(duì)WI-38細(xì)胞（人胚胎肺成纖維細(xì)胞）生長(zhǎng)的抑制作用利用Transwell 體外共同培養(yǎng)體系，將低氧干預(yù)后停滯于G1/S 期的HKC與WI-38 細(xì)胞共同培養(yǎng)，通過Western blot 檢測(cè)WI-38 細(xì)胞系中PCNACyclin D1 變化，探討受低氧干預(yù)后停滯于G1/S 期的增殖型HKC 對(duì)WI-38細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。 【結(jié)果】

7、 1、采用0.1％胎牛血清培養(yǎng)48hhh為HKC血清饑餓法的最佳同步化條件采用0％和0.1％胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24 h、48 h 和72 h后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示采用0％和0.1％胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液在培養(yǎng)48 h 時(shí)，HKC 的G0/G1 比例分別為（90.9±0.9）％和（93.6±2.0）％，與對(duì)照組比較有顯著差異（ P＜0.05）。MTT 生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示0.1％胎牛血清比0％胎牛血清同步化后HKC

8、 恢復(fù)正常培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線更接近于正常HKC 生長(zhǎng)曲線，表明0.1％胎牛血清同步化對(duì)HKC 生長(zhǎng)影響較小。Brdu 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果相同。 2、同步化處理后的HKC在低氧條件下培養(yǎng)可發(fā)生G1/S期阻滯通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)低氧和正常氧條件下同步化處理后的HKC 細(xì)胞周期時(shí)相分布率的對(duì)比，提示在低氧培養(yǎng)12～16 h 時(shí)，同步化處理后HKC 停留在G1/S 期。 Western bolt 方法證實(shí)，與對(duì)照組相

9、比，同步化處理后的HKC 在低氧培養(yǎng)12~16 h 時(shí)細(xì)胞高表達(dá)cdk2 和Cyclin E，證實(shí)其處于G1/S 期。PCNA 免疫細(xì)胞化學(xué)方法證實(shí)在同步化處理后的HKC 在低氧培養(yǎng)12~16 h 具有較強(qiáng)的增殖性。電鏡觀察HKC 在G1/S 期選擇時(shí)段未見明顯凋亡現(xiàn)象。 3、低氧干預(yù)后停滯在G1/S期RTEs抑制WI-38細(xì)胞生長(zhǎng)同步化處理及低氧干預(yù)后阻滯于G1/S 期的HKC 與WI-38 細(xì)胞共培養(yǎng)后，Western bl