miRNA-206通過調(diào)控Cx43表達對乳腺癌細胞影響及其機制的初步探討.pdf

1、在中國女性中,乳腺癌是一高發(fā)病率和高死亡率的惡性疾病,乳腺癌一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,會直接導致乳腺癌患者的生存率大大降低,因此,乳腺癌轉(zhuǎn)移是醫(yī)務工作者在乳腺癌治療遇到的一大難題。連接蛋白(connexin,Cx)是存在于相鄰細胞間的膜通道結(jié)構(gòu)縫隙連接(gap junction,GJ)的基本組成單元,連接蛋白在人類乳腺組織中主要表達Cx26、Cx43;有關連接蛋白43調(diào)節(jié)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的機制研究發(fā)現(xiàn),Cx43介導了相鄰細胞間雙向性、直接的電或化學信號

2、交流,在乳腺癌轉(zhuǎn)移時伴隨有Cx43的表達增加和細胞間信息交流的紊亂。研究發(fā)現(xiàn),在Cx43的啟動子上存在著多個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點,例如:轉(zhuǎn)錄因子SP-1(specificity protein-1)、SP-3、AP-1(activator protein-1)、c-jun等等,多種化學或物理刺激通過這些轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)了Cx43基因的表達。但是,轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控因素眾多,關系復雜,mRNA需要翻譯成蛋白質(zhì)發(fā)揮作用,一個分子最終的功能體

3、現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平;我們的前期研究發(fā)現(xiàn),Cx43的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能參與了乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié),但有關Cx43的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn),Cx43具有抑制細胞內(nèi)肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性、促進肌球蛋白磷酸化的作用,而肌球蛋白輕鏈磷酸酶和肌球蛋白是細胞骨架中重要的調(diào)節(jié)酶和動力系統(tǒng),細胞骨架的改變可以導致癌細胞與細胞外基質(zhì)粘附性和遷移能力異常,對于維持細胞形態(tài)、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、基因表達起著重要作用。
　　微小RN

4、A(microRNA,miRNA)是最大的一類基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,有關乳腺癌中miRNA的研究發(fā)現(xiàn),多種 miRNA通過多個目的基因參與了乳腺癌轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié),前期研究中,我們前期以手術(shù)切除的人乳腺癌原發(fā)灶和配對轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結(jié)為研究對象,研究了微小RNA-206(microRNA-206,miR-206)的表達和Cx43蛋白表達的變化關系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在乳腺癌發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時miR-206的mRNA表達明顯降低,而Cx43的蛋白表達

5、明顯增加,二者有明顯的負相關關系。上述研究提示miR-206可能在乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,而Cx43可能是其下游調(diào)控分子。但是,miR-206是否確實通過Cx43調(diào)節(jié)了乳腺癌的遠處轉(zhuǎn)移及其機制尚不清楚,本研究通過生物信息學預測的方法尋找miR-206與Cx43可能的結(jié)合位點,選擇人乳腺癌細胞系MCF-7及MDA-MB-231,通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法分別提高和降低miR-206的表達,并觀察隨之而來的Cx43的改變以及這些變化給

6、乳腺癌細胞諸如增殖能力,侵襲遷移能力,凋亡率和生長周期的細胞生物學特性帶來的影響。
　　實驗方法和主要結(jié)果:
　　1、miR-206與Cx43表達的相互關系研究:
　　方法:
　　(1)通過生物信息學預測軟件TargetScan和PicTar篩查與Cx43基因——GJA1最配對的miRNA。
　　(2)以熒光素酶配對結(jié)合實驗,針對Cx43基因的3’UTR和預測作用位點,通過系列PCR克隆、基因突變技術(shù)構(gòu)建了

7、Cx43-3'UTR position478-484和position1609-1615的突變質(zhì)粒,觀察miR-206對不同突變位點質(zhì)粒中熒光素酶活性的影響,確定miR-206對Cx43的可能作用位點。
　　(3)通過選取文獻報道Cx43高表達的乳腺癌細胞株MCF-7及Cx43低表達的乳腺癌細胞株MDA-MB-231,通過免疫熒光的方法證實兩種細胞株中Cx43的表達情況;
　　(4)通過qRT-PCR方法檢測兩種細胞株中mi

8、R-206的表達情況。
　　結(jié)果:
　　(1)MCF-7細胞中miR-206的表達量明顯低于MDA-MD-231細胞,MCF-7細胞中的Cx43表達高于MDA-MB-231細胞。
　　(2)熒光素酶配對結(jié)合實驗提示在position478-484突變后抑制效率降低了46.80％;在position1609-1615突變后抑制效率降低了16.72%;全部突變后抑制完全消失。表明miR-206負向調(diào)控Cx43的表達是通過其

9、3'UTR的兩個特定位點實現(xiàn)的,position478-484發(fā)揮的作用可能要強于position1609-1615。
　　2、miR-206通過調(diào)節(jié)Cx43表達從而影響乳腺癌細胞生物學特性的初步機制研究
　　方法:(1)通過慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細胞過表達miR-206,采用qRT-PCR及Western-blot方法檢測Cx43的mRNA和蛋白表達水平,CCK-8法檢測細胞增殖能力,Transwell法檢測細胞侵襲及遷移能

10、力,流失細胞儀檢測細胞凋亡及生長周期。(2)通過慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞抑制miR-206表達,采用qRT-PCR及Western-blot方法檢測Cx43的mRNA和蛋白表達水平,CCK-8法檢測細胞增殖能力,Transwell法檢測細胞侵襲及遷移能力。
　　結(jié)果:
　　(1)過表達MCF-7細胞中miR-206后,細胞中Cx43的mRNA水平及蛋白水平均明顯下降,細胞增殖能力和侵襲遷移能力也明顯減弱。細胞凋亡實

11、驗表明:過表達miR-206后,細胞凋亡率明顯增加。細胞周期實驗表明:過表達miR-206后,細胞周期阻滯在了G2期。
　　(2)抑制MDA-MB-231細胞中miR-206表達后,細胞中Cx43的mRNA水平及蛋白水平均明顯上升,細胞增殖能力和侵襲遷移能力也明顯增強。
　　結(jié)論:
　　1.干預miR-206的表達可引起Cx43 mRNA水平和蛋白水平的表達改變;miR-206與Cx43兩者的表達呈負相關關系;miR-

12、206可能通過指導mRNA降解和抑制蛋白質(zhì)翻譯兩種機制調(diào)節(jié)Cx43表達。
　　2.miR-206可能通過Cx43-3’UTR的position478-484和position1609-1615調(diào)控了Cx43的表達,進而調(diào)節(jié)了乳腺癌的遠處轉(zhuǎn)移。
　　3.干預miR-206的表達后,乳腺癌細胞的增殖能力、侵襲遷移能力、細胞凋亡及細胞周期都受到了影響。過表達miR-206,乳腺癌細胞增殖能力減弱,侵襲遷移能力減弱,細胞凋亡率增加,