miRNA-206通過調(diào)控Cx43表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞影響及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、在中國女性中,乳腺癌是一高發(fā)病率和高死亡率的惡性疾病,乳腺癌一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,會(huì)直接導(dǎo)致乳腺癌患者的生存率大大降低,因此,乳腺癌轉(zhuǎn)移是醫(yī)務(wù)工作者在乳腺癌治療遇到的一大難題。連接蛋白(connexin,Cx)是存在于相鄰細(xì)胞間的膜通道結(jié)構(gòu)縫隙連接(gap junction,GJ)的基本組成單元,連接蛋白在人類乳腺組織中主要表達(dá)Cx26、Cx43;有關(guān)連接蛋白43調(diào)節(jié)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),Cx43介導(dǎo)了相鄰細(xì)胞間雙向性、直接的電或化學(xué)信號

2、交流,在乳腺癌轉(zhuǎn)移時(shí)伴隨有Cx43的表達(dá)增加和細(xì)胞間信息交流的紊亂。研究發(fā)現(xiàn),在Cx43的啟動(dòng)子上存在著多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),例如:轉(zhuǎn)錄因子SP-1(specificity protein-1)、SP-3、AP-1(activator protein-1)、c-jun等等,多種化學(xué)或物理刺激通過這些轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)了Cx43基因的表達(dá)。但是,轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控因素眾多,關(guān)系復(fù)雜,mRNA需要翻譯成蛋白質(zhì)發(fā)揮作用,一個(gè)分子最終的功能體

3、現(xiàn)在蛋白質(zhì)水平;我們的前期研究發(fā)現(xiàn),Cx43的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能參與了乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié),但有關(guān)Cx43的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn),Cx43具有抑制細(xì)胞內(nèi)肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性、促進(jìn)肌球蛋白磷酸化的作用,而肌球蛋白輕鏈磷酸酶和肌球蛋白是細(xì)胞骨架中重要的調(diào)節(jié)酶和動(dòng)力系統(tǒng),細(xì)胞骨架的改變可以導(dǎo)致癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附性和遷移能力異常,對于維持細(xì)胞形態(tài)、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)起著重要作用。
　　微小RN

4、A(microRNA,miRNA)是最大的一類基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,有關(guān)乳腺癌中miRNA的研究發(fā)現(xiàn),多種 miRNA通過多個(gè)目的基因參與了乳腺癌轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié),前期研究中,我們前期以手術(shù)切除的人乳腺癌原發(fā)灶和配對轉(zhuǎn)移的腋窩淋巴結(jié)為研究對象,研究了微小RNA-206(microRNA-206,miR-206)的表達(dá)和Cx43蛋白表達(dá)的變化關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在乳腺癌發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)miR-206的mRNA表達(dá)明顯降低,而Cx43的蛋白表達(dá)

5、明顯增加,二者有明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。上述研究提示miR-206可能在乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,而Cx43可能是其下游調(diào)控分子。但是,miR-206是否確實(shí)通過Cx43調(diào)節(jié)了乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及其機(jī)制尚不清楚,本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測的方法尋找miR-206與Cx43可能的結(jié)合位點(diǎn),選擇人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7及MDA-MB-231,通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法分別提高和降低miR-206的表達(dá),并觀察隨之而來的Cx43的改變以及這些變化給

6、乳腺癌細(xì)胞諸如增殖能力,侵襲遷移能力,凋亡率和生長周期的細(xì)胞生物學(xué)特性帶來的影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法和主要結(jié)果:
　　1、miR-206與Cx43表達(dá)的相互關(guān)系研究:
　　方法:
　　(1)通過生物信息學(xué)預(yù)測軟件TargetScan和PicTar篩查與Cx43基因——GJA1最配對的miRNA。
　　(2)以熒光素酶配對結(jié)合實(shí)驗(yàn),針對Cx43基因的3’UTR和預(yù)測作用位點(diǎn),通過系列PCR克隆、基因突變技術(shù)構(gòu)建了

7、Cx43-3'UTR position478-484和position1609-1615的突變質(zhì)粒,觀察miR-206對不同突變位點(diǎn)質(zhì)粒中熒光素酶活性的影響,確定miR-206對Cx43的可能作用位點(diǎn)。
　　(3)通過選取文獻(xiàn)報(bào)道Cx43高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及Cx43低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231,通過免疫熒光的方法證實(shí)兩種細(xì)胞株中Cx43的表達(dá)情況;
　　(4)通過qRT-PCR方法檢測兩種細(xì)胞株中mi

8、R-206的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1)MCF-7細(xì)胞中miR-206的表達(dá)量明顯低于MDA-MD-231細(xì)胞,MCF-7細(xì)胞中的Cx43表達(dá)高于MDA-MB-231細(xì)胞。
　　(2)熒光素酶配對結(jié)合實(shí)驗(yàn)提示在position478-484突變后抑制效率降低了46.80％;在position1609-1615突變后抑制效率降低了16.72%;全部突變后抑制完全消失。表明miR-206負(fù)向調(diào)控Cx43的表達(dá)是通過其

9、3'UTR的兩個(gè)特定位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的,position478-484發(fā)揮的作用可能要強(qiáng)于position1609-1615。
　　2、miR-206通過調(diào)節(jié)Cx43表達(dá)從而影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的初步機(jī)制研究
　　方法:(1)通過慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞過表達(dá)miR-206,采用qRT-PCR及Western-blot方法檢測Cx43的mRNA和蛋白表達(dá)水平,CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力,Transwell法檢測細(xì)胞侵襲及遷移能

10、力,流失細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及生長周期。(2)通過慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞抑制miR-206表達(dá),采用qRT-PCR及Western-blot方法檢測Cx43的mRNA和蛋白表達(dá)水平,CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力,Transwell法檢測細(xì)胞侵襲及遷移能力。
　　結(jié)果:
　　(1)過表達(dá)MCF-7細(xì)胞中miR-206后,細(xì)胞中Cx43的mRNA水平及蛋白水平均明顯下降,細(xì)胞增殖能力和侵襲遷移能力也明顯減弱。細(xì)胞凋亡實(shí)

11、驗(yàn)表明:過表達(dá)miR-206后,細(xì)胞凋亡率明顯增加。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明:過表達(dá)miR-206后,細(xì)胞周期阻滯在了G2期。
　　(2)抑制MDA-MB-231細(xì)胞中miR-206表達(dá)后,細(xì)胞中Cx43的mRNA水平及蛋白水平均明顯上升,細(xì)胞增殖能力和侵襲遷移能力也明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1.干預(yù)miR-206的表達(dá)可引起Cx43 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)改變;miR-206與Cx43兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;miR-

12、206可能通過指導(dǎo)mRNA降解和抑制蛋白質(zhì)翻譯兩種機(jī)制調(diào)節(jié)Cx43表達(dá)。
　　2.miR-206可能通過Cx43-3’UTR的position478-484和position1609-1615調(diào)控了Cx43的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)了乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
　　3.干預(yù)miR-206的表達(dá)后,乳腺癌細(xì)胞的增殖能力、侵襲遷移能力、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期都受到了影響。過表達(dá)miR-206,乳腺癌細(xì)胞增殖能力減弱,侵襲遷移能力減弱,細(xì)胞凋亡率增加,