內質網應激調控乙酰肝素酶表達的機制及其對乳腺癌細胞侵襲遷移的影響.pdf

1、目的：⑴研究內質網應激（endoplasmic reticulum stress response，ER stress）狀態(tài)對人乳腺細胞MDA-MB-231和MDA-MB-435侵襲遷移的影響。⑵研究ER stress對乳腺癌細胞中乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）表達及活性的影響。⑶探討是否可通過肝素酶抑制劑OGT2115和低分子量肝素（Low molecular weight heparin，LMWH）抑制Hpa而調控ER

2、stress對乳腺癌細胞侵襲遷移的影響。⑷檢測ER stress狀態(tài)下侵襲遷移相關蛋白的變化，探討參與ER stress調控Hpa的機制。
　　方法：①以侵襲能力較強的乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-435為研究對象，使用化療藥物阿霉素（adriamycin，ADM）和ER stress經典誘導劑衣霉素（tunicamycin， TM）誘導細胞ER stress，不同濃度ADM作用于乳腺癌細胞24h、48h、72 h

3、后使用MTT比色法檢測細胞活性，并據此選擇對細胞增殖影響較小的濃度進行接下來的侵襲遷移實驗。②以乳腺癌細胞MDA-MB-231和MDA-MB-435為對象，ADM和TM處理一段時間后Western blot檢測ER stress標志蛋白GRP78和CHOP的表達。③使用Transwell法檢測ADM和TM對兩株乳腺癌細胞侵襲遷移的影響，細胞劃痕實驗觀察細胞的遷移能力。同時使用Western blot、ELISA法檢測ADM、TM刺激乳腺

4、癌細胞后Hpa表達活性的變化。④使用肝素酶抑制劑OGT2115/LMWH后，Transwell法再次檢測ER stress狀態(tài)下兩株細胞的侵襲和遷移的變化；ELISA法檢測Hpa的變化以及Western blot檢測ER stress時侵襲遷移相關蛋白如基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP） MMP-9，IκB-α和上皮細胞間質轉型（epithelial-mesenchymal transition，

5、EMT）蛋白的變化。
　　結果：⑴MTT結果顯示，ADM能明顯抑制兩株乳腺癌細胞的增殖，抑制活性隨著作用時間和劑量的增加而增加；選用對細胞增殖影響較小濃度的ADM和TM進行Transwell侵襲遷移實驗，結果發(fā)現低濃度如ADM（0.2μmol·L-1）和TM（0.75μmol· L-1）一定程度上可以增加乳腺癌細胞的侵襲遷移（p<0.05）。⑵ADM（0.2μmol·L-1）作用于乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435細

6、胞24h后，Western blot檢測結果發(fā)現，化療藥物ADM可以引起ER stress，6h即可檢測到標志蛋白GRP78表達明顯升高。TM作為經典誘導劑，TM（0.75μmol·L-1）作用于兩株乳腺癌細胞后，Western blot檢測GRP78明顯升高，驗證了TM誘導ER stress的能力。ADM和TM刺激兩株乳腺癌細胞24h、36h后，Western blot和ELISA法檢測Hpa的表達活性，結果發(fā)現誘導ER stress

7、可激活Hpa，16h和24h時Hpa明顯升高，繼而引起了一系列侵襲遷移的后效應。⑶考慮到Hpa在ER stress增強乳腺癌細胞侵襲遷移的過程中可能起著關鍵作用，我們使用Hpa本身活性抑制劑OGT2115以觀察其是否可以抑制ER stress引起的細胞侵襲遷移。MTT檢測發(fā)現OGT2115對乳腺癌細胞的增殖抑制作用不強，但和ADM聯合后不會減弱ADM的抗腫瘤增殖作用。ELISA檢測結果發(fā)現OGT2115可以抑制Hpa活性，并且可以明顯抑

8、制被ADM/TM激活的Hpa活性，OGT2115（0.8μmol·L-1）單獨作用于乳腺癌細胞后可以輕度抑制細胞侵襲遷移，并且可以能明顯減少由ER stress引起的細胞侵襲遷移（p<0.05）。⑷使用Hpa的另一類抑制劑肝素類似物LMWH進行重復實驗，MTT檢測LMWH可以輕度抑制乳腺癌細胞的增殖，抑制活性隨著作用時間和劑量的增加而增加。ELISA檢測結果發(fā)現LMWH能明顯抑制由ADM/TM激活的Hpa活性，使用LMWH（500 IU

9、·ml-1）可以明顯減少ADM（0.2μmol·L-1）/TM（0.75μmol· L-1）引起的細胞侵襲遷移（p<0.05），結果與OGT2115的實驗結果相符合。⑸通過上述實驗可知，Hpa在ER stress增加乳腺癌細胞侵襲遷移的過程中有重要的作用，Hpa的表達受到很多因素的影響，Western blot檢測可知TM（0.75μmol· L-1）刺激乳腺癌細胞24h后MMP-9升高，IκB-α降低，NF-κB被激活，EMT蛋白E-

10、cadherin降低、β-catenin降低、vimentin升高，提示可能誘導出現了EMT。使用Hpa抑制劑可以對EMT蛋白進行調控，這提示我們EMT相關通路可能參與了ER stress激活Hpa的過程。
　　結論：①相關濃度化療藥物ADM、TM促進乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-435細胞侵襲和遷移，這與化療藥物誘導的ER stress保護細胞作用過度激活了Hpa密切相關。②通過抑制Hpa可以減少由ER stress