REGgamma在乳腺癌中的表達(dá)特征及其對(duì)ERα調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著患者的健康狀態(tài)和生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)約70％的乳腺癌患者腫瘤組織呈雌激素受體(ERα)陽(yáng)性狀態(tài)，這類(lèi)患者在乳腺癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過(guò)程中可表現(xiàn)為雌激素依賴(lài)狀態(tài)，因此雌激素及雌激素受體狀態(tài)的調(diào)控對(duì)這類(lèi)患者顯得更加重要。蛋白酶體調(diào)控子/共激活因子REGgamma參與乳腺癌、甲狀腺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌等多個(gè)人體惡性腫瘤病理、生理過(guò)程，文獻(xiàn)報(bào)道REGgamma可以對(duì)腫瘤基因、抑癌基因及其蛋白表達(dá)產(chǎn)物發(fā)

2、揮調(diào)控作用。REGgamma在人乳腺癌領(lǐng)域的研究報(bào)道數(shù)量非常稀少，目前我們對(duì)REGgamma在乳腺癌疾病過(guò)程中可能發(fā)揮作用的認(rèn)識(shí)尚不明確。因此值得對(duì)REGgamma的生物學(xué)功能進(jìn)行深入探索，這不僅是對(duì)現(xiàn)有REGgamma生物學(xué)功能理論、知識(shí)體系的有益補(bǔ)充，也可能為提高乳腺癌臨床治療效果提供新的切入點(diǎn)，為乳腺癌的診斷及治療提供新的幫助。
　　1.REGgamma在乳腺癌組織中高表達(dá)，REGgamma高表達(dá)狀態(tài)與乳腺癌轉(zhuǎn)移及不良臨床預(yù)

3、后正相關(guān)
　　目的:探索REGgamma在人乳腺疾病患者乳腺組織及腋窩淋巴結(jié)組織中的表達(dá)特征，分析REGgamma不同表達(dá)狀態(tài)與乳腺癌患者的病理學(xué)特征及臨床預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。
　　方法:使用免疫組織化學(xué)(IHC)技術(shù)和免疫印跡(Western blot)技術(shù)，在136例乳腺癌患者和140例乳腺良性疾病患者組織標(biāo)本中研究REGgamma表達(dá)特征。
　　結(jié)果:1.REGgamma在人乳腺癌組織中高表達(dá)。136例乳腺癌標(biāo)本中1

4、11例(81.6％)REGgamma呈陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)率顯著性高于乳腺良性疾病(9/140，6.4％，p＜0.001)，低于乳腺癌轉(zhuǎn)移腋窩淋巴結(jié)組織(116/116，100％，p＜0.001)。2.REGgamma陽(yáng)性表達(dá)與乳腺癌患者較差的臨床病理學(xué)特征相關(guān)聯(lián)。我們研究發(fā)現(xiàn)REGgamma表達(dá)與下列因素?zé)o關(guān):發(fā)病年齡(p=0.702)、月經(jīng)狀態(tài)(p=0.171)、孕激素受體progesterone receptor(PR)表達(dá)狀態(tài)(p=

5、0.211)以及人表皮生長(zhǎng)因子受體-2human epidermal growth factor receptor-2(HER-2)表達(dá)狀態(tài)(p=0.557)。但是REGgamma高表達(dá)與乳腺腫瘤的大小(p＜0.001)、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)(p＜0.001）、腫瘤TNM分級(jí)(p=0.038)、組織學(xué)分化程度(p=0.001）和雌激素受體(ERα)表達(dá)狀態(tài)(p＜0.001)正相關(guān)。3.REGgamma高表達(dá)與乳腺癌患者不良臨床預(yù)后正相關(guān)。

6、乳腺癌患者5年生存分析(OS和DFS)結(jié)果提示:REGgamma低表達(dá)乳腺癌患者生存率顯著性高于REGgamma高表達(dá)患者(p＜0.05），Cox多因素回歸分析的結(jié)果顯示REGgamma可能作為評(píng)估乳腺癌患者預(yù)后新的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(OR=4.369，p=0.008)。
　　結(jié)論:REGgamma在乳腺癌組織和腋窩癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中高表達(dá)，REGgamma高表達(dá)與乳腺癌患者較差臨床病理學(xué)特征以及不良預(yù)后正相關(guān)。
　　2.MMTV-P

7、yMT小鼠是研究乳腺癌活體中REGgamma表達(dá)模式理想動(dòng)物模型
　　目的:使用MMTV-PyMT人乳腺癌小鼠動(dòng)物模型研究REGgamma在乳腺癌動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)特征。
　　方法:使用免疫組織化學(xué)染色、免疫印跡等方法比較REGgamma在MMTV-PyMT(FVB/N-Tg MMTV-PyVT634Mul/J mice)乳腺癌小鼠動(dòng)物模型和FVB(FVB/NJ，nontransgenic)對(duì)照小鼠乳腺癌組織、正常乳腺組織以及肺

8、轉(zhuǎn)移癌組織、正常肺組織之間表達(dá)的差異性。
　　結(jié)果:1.REGgamma在MMTV-PyMT小鼠乳腺癌和肺轉(zhuǎn)移癌組織中呈高表達(dá)。20只MMTV-PyMT小鼠中14只(70％)乳腺癌組織中REGgamma呈陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)率顯著性高于FVB對(duì)照小鼠正常乳腺組織(0/20，0％，p＜0.001)，低于MMTV-PyMT小鼠肺轉(zhuǎn)移癌組織(20/20，100％，p=0.027)。2.免疫印跡檢測(cè)顯示FVB正常對(duì)照小鼠乳腺組織和肺組織中均未

9、見(jiàn)REGgamma蛋白表達(dá)，MMTV-PyMT小鼠乳腺癌組織(p=0.0051)和肺轉(zhuǎn)移癌組織(p=0.0190)中REGgamma蛋白均呈高表達(dá)。3.20只MMTV-PyMT小鼠(REGgamma高/低表達(dá)組各10只)的生存分析研究顯示，REGgamma高表達(dá)的小鼠生存率(OS)顯著性低于REGgamma低表達(dá)的小鼠。
　　結(jié)論:MMTV-PyMT小鼠是人乳腺癌疾病過(guò)程的近似模擬，是研究REGgamma在乳腺癌動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的理想

10、動(dòng)物模型。REGgamma的表達(dá)水平可以反映MMTV-PyMT乳腺癌荷瘤小鼠的生存預(yù)后。
　　3.REGgamma對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖能力、運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力的影響
　　目的:探索REGgamma對(duì)ERα陽(yáng)性人乳腺癌MCF7和BT474細(xì)胞增殖能力、運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力的影響。
　　方法:使用小RNA干擾(siRNA)技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)(MTS)、細(xì)胞活動(dòng)性檢測(cè)技術(shù)以及侵襲小室檢測(cè)技術(shù)(transwell

11、)，比較REGgamma-siRNA處理前后人乳腺癌MCF7和BT474細(xì)胞表型的差異。
　　結(jié)果:1.經(jīng)過(guò)REGgamma-siRNA處理，乳腺癌MCF7(p=0.0033)和BT474(p=0.0114)細(xì)胞增值能力顯著性下降。2.經(jīng)過(guò)REGgamma-siRNA處理后，人乳腺癌MCF7(p＜0.0001)和BT474(p＜0.0001)細(xì)胞活動(dòng)能力顯著性降低。3.經(jīng)過(guò)REGgamma-siRNA處理，乳腺癌細(xì)胞侵襲能力較對(duì)照

12、組細(xì)胞顯著性下降。MCF7細(xì)胞侵襲性由86.72％下降至24.84％，侵襲指數(shù)(invasion index)為0.2864; BT474細(xì)胞侵襲性由59.65％下降至23.43％，侵襲指數(shù)為0.3928。
　　結(jié)論:乳腺癌細(xì)胞MCF7和BT474經(jīng)過(guò)REGgamma基因下調(diào)處理后，細(xì)胞增殖能力、移動(dòng)能力和侵襲能力均呈顯著性下降，提示REGgamma可能具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞惡性進(jìn)展的潛能。
　　4.REGgamma通過(guò)泛素-蛋

13、白酶體途徑調(diào)控ERα蛋白表達(dá)
　　目的:在乳腺癌MCF7和BT474細(xì)胞中探索REGgamma對(duì)ERα表達(dá)調(diào)控可能的機(jī)制。
　　方法:使用小RNA干擾技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、Real-time PCR定量分析技術(shù)、ERα蛋白半衰期檢測(cè)技術(shù)及ERα-ubiquitin免疫共沉淀分析等技術(shù)手段，在人乳腺癌MCF7和BT474細(xì)胞中檢測(cè)REGgamma對(duì)ERα表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果:1.經(jīng)過(guò)REGgamma-siRNA處理，

14、MCF7(p=0.0108)和BT474(p=0.0065)細(xì)胞內(nèi)ERα蛋白表達(dá)水平顯著性下降，但是MCF7(p=0.3011)和BT474(p=0.2178)細(xì)胞內(nèi)ERα轉(zhuǎn)錄mRNA表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化(p＞0.05）。2.經(jīng)過(guò)REGgamma-siRNA處理，ERα陽(yáng)性人的乳腺癌細(xì)胞ERα蛋白半衰期(half-life time)顯著縮短(REGgamma-siRNA處理后細(xì)胞的半衰期約2小時(shí)，control-siRNA對(duì)照組細(xì)胞

15、的半衰期約4小時(shí))。REGgamma-siRNA處理后，MCF7(p=0.0093)和BT474(p=0.0155)細(xì)胞中ERα蛋白降解速度顯著性加快。3.蛋白酶體抑制劑MG132可以完全阻斷REGgamma對(duì)ERα蛋白的降解的調(diào)控作用。4.ERα-ubiquitin免疫共沉淀分析結(jié)果顯示:REGgamma可能通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑調(diào)控ERα蛋白的降解。REGgamma可以發(fā)揮類(lèi)似ERα穩(wěn)定劑樣作用，抑制人乳腺癌MCF7和BT474細(xì)胞