ECRG4在乳腺癌中的表達與調(diào)控機制及其抗腫瘤作用的研究.pdf

1、目的:
　　食道癌相關(guān)基因4(Esophageal cancer-related gene4，ECRG4)是從人類食管上皮細胞內(nèi)分離出來的新基因，它因在食管鱗癌中的作用而首次被人們發(fā)現(xiàn)。其正式名稱為C2ORF40，基因定位于染色體2q12.2，編碼148個氨基酸殘基的多肽。據(jù)有關(guān)文獻報道，ECRG4在食管鱗癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均表達下調(diào)，在食管鱗癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中起到抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲的功能。因此，在食管鱗

2、癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中ECRG4被看作是一個潛在的抑癌基因，但ECRG4的確切功能目前尚無定論。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌、結(jié)腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中都伴隨著ECRG4啟動子區(qū)CpG島高甲基化的現(xiàn)象，推測可能是這種高甲基化現(xiàn)象引起了ECRG4的基因轉(zhuǎn)錄沉默，從而導致ECRG4表達下調(diào)。但是，ECRG4表達調(diào)控機制仍罕見報道。2011年有研究發(fā)現(xiàn)ECRG4在乳腺癌中表達下調(diào)且與無病生存率相關(guān)，本實驗室的前期工作也發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中E

3、CRG4的表達是下調(diào)的，因此，我們決定針對ECRG4在乳腺癌中的表達與調(diào)控以及抗腫瘤功能進行進一步研究。本研究擬對ECRG4在乳腺癌組織的表達情況進行檢測，探究在乳腺癌組織以及乳腺癌細胞系中ECRG4基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)，探討ECRG4啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與其表達之間的關(guān)系，并初步探索ECRG4在乳腺癌中的抗腫瘤功能，以期找到新的診斷和預(yù)后指標，為以后的分子靶向治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.應(yīng)用半

4、定量RT-PCR和熒光定量PCR(Q-PCR)方法檢測17例配對乳腺癌新鮮組織中內(nèi)源性ECRG4的mRNA表達水平;
　　2.BSP（Bisulfite sequencing PCR）法檢測17例配對乳腺癌新鮮組織ECRG4啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài);
　　3.應(yīng)用BSP和熒光定量PCR(Q-PCR)檢測5-Aza-CdR處理前后SK-BR-3和MCF-7細胞的甲基化狀態(tài)及mRNA表達情況;
　　4.構(gòu)建ECRG4-pcDN

5、A3.1真核表達質(zhì)粒，并用ECRG4-pcDNA3.1表達質(zhì)?；?qū)φ湛召|(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SK-BR-3和MCF-7細胞，轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞總蛋白，Western Blotting檢測蛋白表達水平;
　　5.MTT法檢測轉(zhuǎn)染ECRG4表達質(zhì)粒前后SK-BR-3和MCF-7細胞的增殖能力改變
　　6.流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染ECRG4表達質(zhì)粒24 h后SK-BR-3和MCF-7細胞凋亡的改變
　　7.細胞劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染ECRG4

6、表達質(zhì)粒48 h后MCF-7細胞遷移能力的改變
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR結(jié)果顯示有15例(15/17，88.2％)乳腺癌組織ECRG4的mRNA表達水平低于癌旁乳腺組織(P＜0.05);
　　2.RT-qPCR結(jié)果顯示有16例(16/17，94.1％)乳腺癌組織ECRG4的mRNA表達水平低于癌旁乳腺組織(P＜0.01);
　　3.在乳腺癌組織中ECRG4啟動子區(qū)存在明顯的高甲基化現(xiàn)象;
　　4.5

7、-Aza-CdR處理SK-BR-3和MCF-7細胞72 h后其ECRG4啟動子區(qū)甲基化程度明顯減弱， ECRG4 mRNA的表達得以恢復(fù)和上調(diào)，且具有5-Aza-CdR濃度劑量依賴性;
　　5.過表達ECRG4抑制了乳腺癌細胞系SK-BR-3和MCF-7的增殖(P＜0.05);
　　6.過表達ECRG4抑制了乳腺癌細胞系MCF-7的遷移(P＜0.05);
　　7.過表達ECRG4能夠促進乳腺癌細胞系SK-BR-3和MC