PAK4在乳腺癌發(fā)病機(jī)制和診斷中的作用研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位,占全身各種惡性腫瘤的7％-10％,是危害婦女健康的主要腫瘤。全世界每年約有120～140萬婦女發(fā)生乳腺癌,約有50萬婦女死于該病。北美、北歐是乳腺癌的高發(fā)地區(qū),其發(fā)病率約為亞、非、拉美地區(qū)的4倍。我國雖是乳腺癌的低發(fā)地區(qū),但其發(fā)病率逐年上升,每年遞增3％左右,尤其滬、京、津及沿海地區(qū)是我國乳腺癌的高發(fā)地區(qū),以上海最高,1972年上海的乳腺癌標(biāo)化發(fā)病率為17/10萬,1995

2、年則為38/10萬,為女性惡性腫瘤發(fā)病率中的第1位。如何有效地預(yù)防和治療乳腺癌成為人們關(guān)注的焦點。
　　 隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展,研究者們逐漸認(rèn)識到在真核細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中,通路蛋白的磷酸化和去磷酸化修飾足信號通路調(diào)控的重要方式,兩者之間的平衡在細(xì)胞正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用。p21-activated kinase(PAKs)即p21小GTP酶活化激酶,是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸化激酶家族。分子

3、量為21 kD、Rho家族的小GTP酶即Cdc42和Rac1是PAKs的上游分子(即PAKs為Cdc42和Rac1的效應(yīng)分子)。在分子結(jié)構(gòu)上,PAK N-末端為激酶的調(diào)節(jié)區(qū),C-末端為激酶的底物結(jié)合區(qū),具有激酶活性。PAK4-3構(gòu)成第一組PAK,分子量為62-64 kD,其激活需要Cdc42和Rac。PAK4-6構(gòu)成第二組PAK,分子量為65-68 Kd。除調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、正常的細(xì)胞生長,分化和凋亡外,PAK家族成員還在人類疾病中起重要作

4、用。PAK4是PAK家族中與人類腫瘤關(guān)系密切的成員,其在細(xì)胞骨架修復(fù)、延長正常細(xì)胞壽命和正向調(diào)節(jié)一些正常生理代謝等方面都起重要作用。PAK4為第二組PAK中最先別報道者,能在大多被檢組織中檢測到,但在乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞中PAK4的表達(dá)遠(yuǎn)高于其它腫瘤細(xì)胞,而且PAK4表達(dá)與乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。但PAK4在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、演化和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚未明確,因此本課題在系統(tǒng)地檢測PAK4在乳腺癌旁正常組織-乳腺囊性增生

5、病-乳房纖維腺瘤-原發(fā)性乳腺痛組織-乳腺痛轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)差異和分布特點基礎(chǔ)上,同時構(gòu)建PAK4真核表達(dá)載體和PAK4 shRNA真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染乳腺痛MDA-MB-231細(xì)胞,觀察上調(diào)和下調(diào)乳腺痛細(xì)胞PAK4表達(dá)后對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡,細(xì)胞粘附、運(yùn)動、侵襲和致瘤等生物學(xué)活性的影響,以期深入了解PAK4在乳腺癌細(xì)胞演化和轉(zhuǎn)移中的作用和機(jī)制,并探討PAK4作為乳腺癌轉(zhuǎn)移標(biāo)志和作為潛在治療靶點的可能性。
　　 研究方法

6、　　 一、PAK4在良性及惡性乳腺病變中的表達(dá)檢測及意義
　　 用免疫組織化學(xué)S-P法檢測PAK4在乳腺痛痛旁正常組織、乳腺囊性增生病、乳房纖維腺瘤、乳腺癌和乳腺癌轉(zhuǎn)移瘤組織中的表達(dá),并分析PAK4表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系。
　　 二、PAK4對乳腺癌細(xì)胞表型的影響
　　 利用基因重組技術(shù)分別構(gòu)建PAK4真核表達(dá)載體和PAK4 shRNA真核表達(dá)載體,并以乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231作為模型,轉(zhuǎn)染重組載

7、體后觀測對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)活性的影響。
　　 1、PAK4真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 按照 GenBank 上公布的PAK4 mRNA序列,在其編碼區(qū)(CDS)設(shè)計兩端帶有EcoRI和BamH I酶切位點的引物,利用PCR擴(kuò)增PAK4 CDS區(qū)。EcoRI和BamH I雙酶切純化的PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pEGFP/C1,T4連接酶連接酶切純化后的PCR產(chǎn)物和酶切純化后的pEGFP/C1,轉(zhuǎn)化到乳腺桿菌DH5a中

8、。挑單菌落培養(yǎng)擴(kuò)增,提取重組質(zhì)粒后行酶切鑒定,選擇插入片段正確的克隆測序鑒定。
　　 2、PAK4 shRNA重組載體的構(gòu)建 根據(jù)siRNA設(shè)計的原則,在PAK4 mRNACDS設(shè)計3對siRNA核苷酸序列,并設(shè)計一對非相關(guān)核苷酸序列作為對照,經(jīng)GenBank在線BLAST確定確定與其它人類基因無高度同源后,分布在所設(shè)計的siRNA兩端分別加上帶有BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶切位點的shRNAs單鏈送公司合成。復(fù)性合成雙鏈,按常規(guī)

9、操作把shRNA序列克隆到pRNAT-U6.1/Neo載體中,重組質(zhì)粒酶切和測序鑒定。
　　 3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞和建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆 采用Invintrogen公司的Lipofectamine2000TM脂質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后用分別用G418篩選陽性細(xì)胞克隆,挑取單克降細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。
　　 4、PAK4表達(dá)調(diào)控效應(yīng)檢測RT-PCR和免疫印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)與激光共聚焦顯微鏡檢測PAK4 mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)改

10、變。
　　 5、細(xì)胞增殖與凋亡MTT法檢測PAK4對乳腺痛細(xì)胞MDA-MB-231增殖的影響；采用DNA片段法檢測PAK4對5-Fu誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。
　　 6、細(xì)胞基質(zhì)粘附實驗 參照文獻(xiàn)的方法研究PAK4對乳腺痛細(xì)胞MDA-MB-231粘附的影響。
　　 7、單層細(xì)胞劃痕愈傷實驗分析單層細(xì)胞劃痕愈傷實驗分析PAK4對乳腺痛細(xì)胞移行的影響。
　　 8、侵襲實驗觀察改變PAK4表達(dá)對乳腺痛細(xì)胞侵襲能力的

11、影響。
　　 9、軟瓊脂糖集落形成實驗觀察RNAi沉默PAK4表達(dá)對MDA-MB-231細(xì)胞錨著獨立性生長的影響。
　　 10.裸鼠成瘤實驗 觀察PAK4表達(dá)對MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠成瘤的影響,包括成瘤瘤體大小、侵襲轉(zhuǎn)移部位差異。
　　 三、對PAK4在乳腺痛惡性程度診斷及預(yù)后中的作用進(jìn)行初步研究
　　 選擇乳腺痛中的一個特殊部分即三陰乳腺癌(TNBC)進(jìn)行研究,探討PAK4在TNBC的發(fā)病機(jī)制中是

12、否起了特殊作用；并對乳腺癌組織中PAK4表達(dá)不同的患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的情況進(jìn)行對照,
　　 研究結(jié)果
　　 一、PAK4在良、惡性乳腺病變中的表達(dá)及意義
　　 1.乳腺癌、乳房纖維腺瘤等組織的PAK4陽性產(chǎn)物主要位于胞漿,尤以核周明顯,細(xì)胞基質(zhì)未見明顯染色。
　　 2.正常乳腺組織(或乳腺囊性增生病)、乳房纖維腺瘤、乳腺癌和乳腺癌轉(zhuǎn)移瘤組織中的PAK4表達(dá)總體陽性率依次升高；提示PAK4與乳腺癌演進(jìn)和轉(zhuǎn)移密切

13、相關(guān)。
　　 3.在非浸潤性癌、早期浸潤痛、浸潤癌三利不同病理分期的乳腺痛組織中PAK4的表達(dá)呈明顯依次升高趨勢,各組兩兩比較均有顯著性差異。
　　 二、PAK4對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響
　　 1.成功構(gòu)建了PAK4真核表達(dá)載體pEGFP-C1/PAK4,并經(jīng)酶切和測序鑒定證實；成功構(gòu)建了PAK4 shRNA真核表達(dá)載體pRNA6.1/Neo-shRNA1、pRNA6.1/Neo-shRNA2、pRNA6.1

14、/Neo-shRNA3和PAK4 shRNA非相關(guān)序列載體pRNA6.1/Neo-shRNA-N,并經(jīng)酶切和測序鑒定證實插入序列與設(shè)計的完全一致。
　　 2.重組載體轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞,經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞克隆株。
　　 3.與對照pRNA6.1/Neo-shRNA-N和pRNA6.1/Neo相比,pRNA6.1/Neo-shRNA1、pRNA6.1/Neo-shRNA2和pRNA6.1/Neo-shRN

15、A3可以有效下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)源性PAK4 mRNA和蛋白的表達(dá)；pEGFP-C1/PAK4在MDA-MB-231細(xì)胞漿中穩(wěn)定表達(dá),提示MDA-MB-231PAK4建株成功。
　　 4.PAK4高表達(dá)可以促進(jìn)大腸癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖,下調(diào)PAK4表達(dá)則可以抑制大腸痛細(xì)胞的增殖；PAK4高表達(dá)可以增強(qiáng)大腸痛細(xì)胞的異質(zhì)粘附,下調(diào)PAK4表達(dá)則抑制MDA-MB-231細(xì)胞的異質(zhì)粘附；PAK4增強(qiáng)大腸癌細(xì)胞的非錨定

16、依賴式生長,下調(diào)PAK4表達(dá)則抑制大腸癌細(xì)胞的集落形成能力；PAK4增強(qiáng)大腸癌細(xì)胞移行能力,下調(diào)PAK4表達(dá)則明顯抑制大腸癌細(xì)胞的移行能力；PAK4增強(qiáng)大腸癌細(xì)胞對基質(zhì)的侵襲能力,下調(diào)PAK4表達(dá)則可以減弱大腸癌細(xì)胞的侵襲力。
　　 5.PAK4可以抗5-Fu誘導(dǎo)的大腸癌凋亡,抑制PAK4表達(dá)可以增強(qiáng)大腸癌細(xì)胞對5-Fu的敏感性。PAK4高表達(dá)可以促進(jìn)大腸癌細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶2,提示PAK4增加大腸痛細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能可能與增強(qiáng)

17、基質(zhì)金屬蛋白酶2的活性有關(guān)。
　　 6.血管內(nèi)皮生長因了可以誘導(dǎo)PAK4在大腸痛細(xì)胞中的表達(dá),提示VEGF可能通過PAK4 影響大腸痛細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；裸鼠成痛實驗顯示,抑制PAK4基因的表達(dá),可以負(fù)向調(diào)節(jié)大腸痛細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。
　　 三、PAK4在乳腺痛診斷中的作用的初步研究
　　 對PAK4在乳腺痛惡性程度診斷及預(yù)后中的作用進(jìn)行的研究顯示:
　　 1.三陰乳腺痛患者PAK4的表達(dá)率及表達(dá)量均明顯高于