RASSF6和miR-7-5p在人乳腺癌中的作用和機制.pdf

1、第一部分 RASSF6在人乳腺癌中的甲基化檢測及功能機制研究
　　目的：
　　1檢測RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族成員6(Ras association(RalGDS/AF-6) domain family member6,RASSF6)在人乳腺癌細胞株中及乳腺癌組織中的表達情況；
　　2檢測RASSF6啟動子CpG島在人乳腺癌細胞株和人乳腺癌組織中甲基化情況；
　　3驗證RASSF6對人乳腺癌細胞增殖，細胞周期，細胞凋亡

2、，細胞遷移侵襲方面的調(diào)控作用；
　　4探討介導RASSF6抑癌作用相關(guān)的信號通路改變。
　　方法：
　　1采用RT-PCR檢測RASSF6在人正常組織、人乳腺癌細胞株和人正常乳腺組織中的表達情況；采用Western blot檢測RASSF6在人乳腺癌細胞株中的表達情況；采用Real-time PCR檢測RASSF6在人乳腺癌組織和癌旁組織中的表達情況；分析 Oncomine微陣列芯片數(shù)據(jù)庫中，RASSF6在人乳腺癌正常

3、組織及癌組織中的表達情況。
　　2使用甲基化特異性PCR（Methylation-specific PCR，MSP）檢測 RASSF6在人乳腺癌細胞株和人乳腺癌組織中的啟動子甲基化情況；使用BGS檢測＃115號乳腺癌樣本中RASSF6啟動子甲基化情況。
　　3體外實驗中，使用平板克隆實驗，軟瓊脂克隆實驗，CCK-8實驗， EdU摻入實驗檢測RASSF6對人乳腺癌細胞增殖能力的調(diào)控作用。
　　4體內(nèi)實驗中，使用裸鼠成瘤實

4、驗驗證RASSF6對人乳腺癌細胞增殖能力的調(diào)控作用。
　　5采用流式細胞儀檢測RASSF6對人乳腺癌細胞的細胞周期的調(diào)控作用，并采用Western blot檢測RASSF6對p21和p27的調(diào)控作用。
　　6采用AO/EB染色和流式細胞儀檢測RASSF6對人乳腺癌細胞凋亡的誘導作用，并用Western blot檢測cleaved-caspase3， cleaved-caspase7，cleaved-caspase9，clea

5、ved-PARP的變化。
　　7采用劃痕實驗和 Transwell小室檢測RASSF6對人乳腺癌細胞遷移能力的調(diào)控作用；采用 Transwell小室檢測RASSF6對人乳腺癌細胞侵襲能力的調(diào)控作用；采用Real-time PCR和Western blot檢測RASSF6對S100A4，MMP2的調(diào)節(jié)作用。
　　8采用Western blot檢測RASSF6對Akt信號通路的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1 RASS

6、F6在人正常組織和人正常乳腺組織中廣泛表達；而在人乳腺癌細胞株中，多個細胞表達下調(diào)或缺失，包括 BT549和MDA-MB-231等三陰性乳腺癌細胞株；相對于人乳腺癌旁組織， RASSF6在人乳腺癌組織的表達顯著下調(diào)。
　　2 RASSF6在 BT549和MDA-MB-231細胞株中檢測到甲基化，在人乳腺癌組織中檢測到廣泛甲基化。
　　3體外實驗中，平板克隆形成實驗和軟瓊脂克隆形成實驗顯示RASSF6可顯著抑制人乳腺癌細胞的克

7、隆形成能力；CCK-8實驗和EdU摻入實驗顯示出 RASSF6抑制增殖的能力；體內(nèi)實驗中， RASSF6可顯著抑制移植瘤的生長速度。
　　4流式細胞結(jié)果顯示RASSF6可顯著抑制G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，且顯著上調(diào)p21；AO/EB染色和流式細胞結(jié)果顯示RASSF6可誘導人乳腺癌凋亡，且caspase3，caspase7，caspase9，PARP發(fā)生剪切。
　　5劃痕實驗和 Transwell實驗顯示RASSF6可顯著抑制人

8、乳腺癌細胞的遷移和侵襲，且顯著下調(diào)S100A4和MMP2的表達。
　　6Western blot結(jié)果顯示RASSF6可顯著下調(diào)Akt的磷酸化水平，而Akt為S100A4和MMP2的上游信號通路。
　　結(jié)論：
　　1 RASSF6由于啟動子 DNA甲基化導致其在人乳腺癌組織中的表達顯著下調(diào)。
　　2 RASSF6通過抑制Akt信號通路調(diào)控人乳腺癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。
　　第二部分 miR-7-5

9、p靶向REGγ抑制人乳腺癌細胞增殖
　　目的：
　　1驗證敲減 miR-7-5p對人乳腺癌細胞增殖的調(diào)控作用以及對 REGγ表達的調(diào)節(jié)作用。
　　2驗證REGγ是否會逆轉(zhuǎn)miR-7-5p抑制人乳腺癌細胞增殖功能。
　　3體內(nèi)實驗驗證miR-7-5p抑制人乳腺癌細胞增殖。
　　方法：
　　1使用瞬時轉(zhuǎn)染miR-7-5p抑制劑抑制miR-7-5p的表達，采用CCK-8實驗檢測細胞增殖能力以及使用Weste

10、rn blot檢測REGγ蛋白水平變化；并使用流式細胞儀檢測細胞周期改變。
　　2共轉(zhuǎn)染 miR-7-5p和REGγ，采用CCK-8實驗檢測細胞增殖能力以及采用流式細胞術(shù)檢測細胞周期改變。
　　3使用過表達 RASSF6的細胞株以及對照細胞株構(gòu)建裸鼠移植瘤模型；測量移植瘤的體積和重量；且使用免疫組化檢測Ki-67和REGγ的變化。
　　4提取 Oncomine微陣列芯片數(shù)據(jù)驗證在同樣的乳腺癌組織中miR-7-5p和RE

11、Gγ之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1敲減miR-7-5p可促進人乳腺癌細胞的增殖能力，促進G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，且REGγ蛋白水平有顯著上調(diào)。
　　2 REGγ可部分逆轉(zhuǎn)miR-7-5p的抑增殖功能，細胞周期結(jié)果顯示出相同的變化。
　　3移植瘤構(gòu)建成功，miR-7-5p可顯著抑制移植瘤的生長；移植瘤切片顯示增殖相關(guān)基因Ki-67顯著下調(diào)及REGγ蛋白水平顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1 miR-7-