細(xì)胞周期進(jìn)程中Cx43蛋白和AKAP95蛋白相互作用關(guān)系的研究.pdf

1、細(xì)胞的分裂和增殖依賴于細(xì)胞周期的精確調(diào)控。Cx43蛋白是一種可通過控制細(xì)胞周期來抑制腫瘤的蛋白。AKAP95蛋白與細(xì)胞周期密切相關(guān)，可與細(xì)胞周期蛋白相互結(jié)合。AKAP95蛋白是PKA的錨定蛋白，PKA可磷酸化Cx43蛋白的絲氨酸位點(diǎn)。
　　 為了研究細(xì)胞周期不同時(shí)相下AKAP95蛋白與Cx43蛋白的相互作用關(guān)系，選用了L-O2細(xì)胞和A549細(xì)胞。為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的同步化，選用了含羞草堿、阿菲迪霉素、噻氨酯噠唑和秋水仙堿四種細(xì)胞周期阻斷

2、試劑，分別將細(xì)胞阻斷于G1、S、G2和M期，同時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光法測(cè)定四種試劑的阻斷效率。在A549細(xì)胞中，采用細(xì)胞免疫熒光方法觀察細(xì)胞不同時(shí)相下AKAP95蛋白與Cx43蛋白的定位和共定位，用免疫印跡和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來研究?jī)煞N蛋白在細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相下的表達(dá)量及相互作用關(guān)系。在L-O2細(xì)胞中，用免疫印跡和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來研究?jī)煞N蛋白在細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相下的定位、表達(dá)量及相互作用關(guān)系。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cx43蛋白和AKAP95蛋白在

3、兩種細(xì)胞中均存在相互作用關(guān)系，且相互作用主要存在于分裂期。兩種蛋白的定位和表達(dá)量隨著細(xì)胞周期的進(jìn)行而發(fā)生變化，且在兩種細(xì)胞內(nèi)的變化不相同。
　　 為了研究PKA的活性對(duì)Cx43蛋白和AKAP95蛋白相互作用的影響，選用了PKA抑制劑H-89和PKA激活劑Foskolin分別處理A549細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PKA活性不改變A549細(xì)胞中AKAP95蛋白與Cx43蛋白的定位情況，但PKA活性可影響有絲分裂過程