人巨細(xì)胞病毒UL141編碼蛋白相互作用蛋白的篩選和功能研究.pdf

1、目的：
　　人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)感染在人群中普遍存在，可引起新生兒多種畸形和疾病，也可引起免疫低下患者的致死性感染，其危害巨大。有學(xué)者推測(cè)HCMVUL/b'區(qū)可能在病毒的復(fù)制、潛伏和對(duì)宿主的致病性方面起重要作用，因而UL/b'區(qū)基因及編碼蛋白在HCMV感染和致病性方面受到特殊關(guān)注。位于HCMVUL/b'區(qū)內(nèi)的UL141基因，其編碼產(chǎn)物是糖蛋白雙聯(lián)體，分子量在37-40kDa之間。目前

2、已知其編碼蛋白能夠抑制細(xì)胞表面CD155，CD122，TRAIL-R1以及TRAIL-R2的表達(dá)，從而逃避NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用。本文從酵母雙雜交篩選、Pull-down、激光共聚焦技術(shù)、免疫共沉淀等技術(shù)篩選并鑒定HCMVUL141編碼蛋白與胎腦文庫(kù)組織相互作用的蛋白以及相互作用蛋白對(duì)HCMV復(fù)制的影響。以上研究將有利于闡明病毒基因在致病和復(fù)制中的功能，進(jìn)而深入理解HCMV的感染機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)材料與方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)

3、材料
　　標(biāo)本來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒室保存的臨床低傳代HCMV分離株H株（傳代次數(shù)＜5次）。MatchmakerGALTwo-HybridSystem購(gòu)自Clontech公司(Japan)。人胎腦cDNA文庫(kù)由武漢大學(xué)生命科學(xué)院肖庚富教授惠贈(zèng)。MagneGSTTMPull-downSystem試劑盒購(gòu)于Promega公司(USA)。ProFoundc-MycTagIp/Co-IpKit，ProFoundHATagIp/C

4、o-IpKit試劑盒購(gòu)于ThermoScientific公司(USA)。Lipofectamine2000,LipofectamineRNAiMAXReagent購(gòu)于Invitrogen公司。細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于TIANGEN公司。PowerSYBRGreenPCRMasterMin購(gòu)于LifeTechnologies公司(USA)。引物合成及測(cè)序由Invitrogen公司(Shanghai，China)完成。常用數(shù)據(jù)庫(kù)及分析

5、軟件如基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)庫(kù)、引物設(shè)計(jì)軟件等。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　（一）酵母雙雜交篩選
　　1、以HCMVH株的DNA為模板，利用PCR擴(kuò)增獲得UL141基因片段，將Sfi-Ⅰ和Sal-Ⅰ酶切后的UL141基因片段連接至同時(shí)酶切的pGBKT7載體上，構(gòu)建pGBKT7-UL141重組質(zhì)粒，PCR鑒定，并測(cè)序分析驗(yàn)證。
　　2、將pGBKT7-UL141重組質(zhì)粒與人胎腦eDNA文庫(kù)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化至酵母菌株A

6、H109中，涂布于二缺（SD/-Leu/-Trp）及四缺（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出，以X-gal篩選藍(lán)色的陽(yáng)性克隆。
　　3、提取陽(yáng)性克隆的酵母質(zhì)粒，電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中，在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中篩選出含cDNA文庫(kù)的陽(yáng)性克隆。進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，觀察其在四缺培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況。
　　4、鑒定后的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)Genbank生物信息學(xué)軟件進(jìn)行BLAST分析。

7、r>　?。ǘ㏄ull-down技術(shù)鑒定
　　1、利用EcoRⅠ和XhoⅠ兩種限制性內(nèi)切酶，酶切文庫(kù)質(zhì)粒pACT2-CELF5，克隆到同時(shí)雙酶切的含有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-2載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-CELF5。
　　2、利用TNT體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，將pGBKT7-UL141重組質(zhì)粒作為捕獲蛋白進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄;提取在大腸桿菌中表達(dá)的pGEX-CELF5蛋白，作為誘餌蛋白將其固相化到MagneGSTTMparticle

8、s上，按照MagneGSTTMPull-downSystem操作進(jìn)行，將兩種蛋白共同孵育，洗脫，純化，Westernblot技術(shù)分析相互作用的蛋白復(fù)合物，電化學(xué)發(fā)光法鑒定結(jié)果并分析。
　?。ㄈ┘す夤簿劢辜夹g(shù)的細(xì)胞定位分析
　　1、將含有EcoRⅠ和BamHⅠ粘性末端的UL141基因片段，克隆到同時(shí)雙酶切的含有綠色免疫熒光標(biāo)記的pEGFP-C1載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-UL141;采用同樣的方法將篩選得到的文庫(kù)質(zhì)?？寺?/p>

9、到含有紅色免疫熒光標(biāo)記的pDsRed-C1載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pDsRed-CELF5，并測(cè)序分析驗(yàn)證。
　　2、培養(yǎng)人胚腎293T細(xì)胞。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將pEGFP-UL141和pDsRed-CELF5共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，利用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察兩種蛋白表達(dá)及定位情況。
　?。ㄋ模〤o-Immunoprecipitation技術(shù)鑒定
　　1、利用Sfi-Ⅰ和Not-Ⅰ兩種限制性內(nèi)切酶，酶切質(zhì)粒pGBKT

10、7-UL141，克隆到同時(shí)雙酶切的pCMV-Myc載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-Myc-UL141;利用EcoRⅠ和XhoⅠ兩種限制性內(nèi)切酶，采用同樣的方法將篩選得到的文庫(kù)質(zhì)?？寺〉絧CMV-HA載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-HA-CELF5，并測(cè)序分析驗(yàn)證。
　　2、培養(yǎng)人胚腎293T細(xì)胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將pCMV-UL141和pCMV-CELF5共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后裂解細(xì)胞并提取上清，按照ProFou

11、ndc-MycTagIp/Co-IpKit及ProFoundHATagIp/Co-IpKit操作說(shuō)明，將上清分別與含有c-Myc及HA抗體的瓊脂糖孵育，洗脫，最后采用Westernblot技術(shù)分析相互作用的蛋白復(fù)合物，電化學(xué)發(fā)光法分析、鑒定結(jié)果。
　?。ㄎ澹?shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析蛋白功能
　　1、培養(yǎng)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U373MG細(xì)胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將pCMV-CELF5、SiRNA-CELF5、C-SiRNA分別轉(zhuǎn)染入

12、U373MG細(xì)胞中，提取相應(yīng)細(xì)胞蛋白，Westernblot技術(shù)分析過(guò)表達(dá)及干擾CELF5的結(jié)果。
　　2、上述細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后感染HCMV，感染48小時(shí)后收集細(xì)胞提取相應(yīng)細(xì)胞DNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法分別檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞中HCMVDNA的相對(duì)量。
　　結(jié)果：
　　一、酵母雙雜交
　　1、用特異性引物成功擴(kuò)增出HCMVUL141基因片段，片段長(zhǎng)度為1017bp并成功將其克隆到酵母系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄結(jié)合域pGBKT7載體上，

13、命名為pGBKT7-UL141，測(cè)序分析顯示結(jié)果與預(yù)期一致。測(cè)序結(jié)果表明融合區(qū)域的讀碼框正確，經(jīng)測(cè)序證實(shí)為HCMVUL141序列且無(wú)堿基突變。
　　2、將pGBKT7-UL141重組質(zhì)粒與人胎腦cDNA文庫(kù)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞AH109中，經(jīng)過(guò)重復(fù)篩選從SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板篩選出24個(gè)陽(yáng)性克隆。
　　3、對(duì)驗(yàn)證后陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序和生物信息學(xué)分析共獲得以下6個(gè)候選基因:CHD3，編碼人染色質(zhì)解旋酶

14、DNA結(jié)合蛋白3;DNAJB1，編碼熱休克蛋白40亞族B1;DACH1，編碼人細(xì)胞命運(yùn)決定因子;TLE1，編碼轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白樣增強(qiáng)子1;WTIP，編碼腎母細(xì)胞瘤相互作用蛋白1;CELF5，編碼人胚胎致死異常視覺(jué)家族蛋白5，其中篩選的陽(yáng)性克隆與CELF5高度同源，同源性100％。
　　二、Pull-down技術(shù)鑒定
　　1、將文庫(kù)質(zhì)粒pACT2-CELF5用EcoR1和Xho1酶切后克隆到含有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-2載體上，P

15、CR鑒定，測(cè)序分析，克隆成功。
　　2、將重組質(zhì)粒pGEX-CELF5轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，CELF5融合蛋白成功表達(dá)。
　　3、按照MagneGSTTMPull-downSystem操作，通過(guò)Westernblot的方法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種蛋白在體外發(fā)生直接的相互作用。
　　三、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)鑒定
　　1、采用EcoR1和BamH1限制性內(nèi)切酶，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-UL1

16、41和pDsRed-CELF5，PCR鑒定，測(cè)序分析顯示克隆成功。
　　2、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將上述兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至生長(zhǎng)狀態(tài)良好的具有75％融合度的人胚腎293T細(xì)胞中，48小時(shí)后，通過(guò)共聚焦顯微鏡，利用488-nm波長(zhǎng)和543-nm波長(zhǎng)激光束觀察蛋白分布，觀察到HCMVUL141編碼蛋白與CELF5編碼蛋白共定位于細(xì)胞質(zhì)。
　　四、免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步鑒定
　　1、分別采用Sfi-Ⅰ、Not-Ⅰ以及EcoR

17、-Ⅰ、Xho-Ⅰ兩對(duì)限制性內(nèi)切酶，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-Myc-UL141和pCMV-HA-CELF5，PCR鑒定，測(cè)序分析顯示克隆成功。
　　2、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將上述兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至生長(zhǎng)狀態(tài)良好的具有90％融合度的人胚腎293T細(xì)胞中，24小時(shí)后收集并裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，將上清分別與含有c-Myc及HA抗體的瓊脂糖孵育，經(jīng)洗脫，最后通過(guò)c-Myc及HA抗體進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種蛋白在體內(nèi)發(fā)

18、生相互作用。
　　五、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析蛋白功能
　　1、培養(yǎng)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U373MG細(xì)胞，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將pCMV-HA-CELF5、SiRNA-CELF5、C-SiRNA分別轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)373MG細(xì)胞中，提取相應(yīng)細(xì)胞蛋白，通過(guò)CELF5抗體進(jìn)行Westernblot檢測(cè)，結(jié)果顯示在U373MG細(xì)胞中成功過(guò)表達(dá)及干擾CELF5。
　　2、上述細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24h后感染HCMV，感染48小時(shí)后收集細(xì)胞提取相應(yīng)細(xì)胞

19、DNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法分別檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞中HCMVDNA的相對(duì)量，結(jié)果提示過(guò)表達(dá)CELF5能夠促進(jìn)HCMV的復(fù)制，干擾CELF5的表達(dá)對(duì)HCMV的復(fù)制沒(méi)有明顯影響。
　　結(jié)論：
　　應(yīng)用酵母雙雜交初步篩選出HCMVUL141蛋白和人胎腦文庫(kù)蛋白CELF5發(fā)生相互作用，通過(guò)Pull-down、免疫共沉淀以及激光共聚焦實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)這兩種蛋白間的相互作用并共同定位于細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)CELF5的過(guò)表達(dá)促進(jìn)