戊型肝炎病毒ORF2蛋白與豬肝細(xì)胞蛋白相互作用的研究.pdf

1、戊型肝炎病毒(HepatitisEVirus,HEV)是戊型肝炎(HepatitisE,HE)的病原體,主要經(jīng)糞口途徑傳播。HEV為單股正鏈無(wú)包膜RNA病毒,基因組長(zhǎng)約7.2Kb,包含三個(gè)開(kāi)放編碼區(qū),ORF1、ORF2、ORF3,其中ORF2蛋白為病毒衣殼的主要成份,衣殼蛋白與宿主細(xì)胞的特異性結(jié)合啟動(dòng)HEV的復(fù)制過(guò)程,是決定HEV對(duì)宿主細(xì)胞親嗜性的首要步驟。哺乳動(dòng)物HEV有4個(gè)基因型(1-4型),4種型別之間HEV核苷酸序列的相似性在8

2、0％左右,但宿主范圍有一定差異,1型和2型HEV只感染人,3型和4型HEV既感染人也感染豬,并且豬是其主要的儲(chǔ)存宿主。
　　本課題擬通過(guò)對(duì)HEV與豬肝蛋白相互作用的研究,篩選并確認(rèn)與HEV有特異性結(jié)合作用的豬肝蛋白,分析這些蛋白在病毒復(fù)制過(guò)程中的作用,進(jìn)一步通過(guò)比較基因1型、4型HEV與豬肝蛋白結(jié)合能力的差異,分析HEV宿主限制性及跨種屬感染的機(jī)制。
　　我們利用分裂-泛素酵母雙雜交系統(tǒng),分別以基因1型HEVORF2和基因4

3、型HEVORF2蛋白為誘餌對(duì)豬肝臟cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選,經(jīng)過(guò)三次文庫(kù)篩選,運(yùn)用酵母共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)去除酵母雙雜交假陽(yáng)性結(jié)果,得到與1型HEVORF2相互作用的豬肝蛋白9個(gè),與4型HEVORF2相互作用的豬肝蛋白17個(gè)。酵母共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)后比較與基因1型和4型HEVORF2相互作用的蛋白,有9個(gè)相同蛋白和8個(gè)不同蛋白,8個(gè)不同蛋白分別為Yip1家族5(YIPF5)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sec61β亞單位(SEC61B)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力相關(guān)蛋白1(SERP1)、

4、AtlastinGTP酶2(ATL2)、細(xì)胞色素b5(CYB5A)、趨化素樣因子超家族6(CMTM6)、線粒體載體同源物2(MTCH2)、NADP轉(zhuǎn)氫酶(NNT),其中CMTM6蛋白分布在細(xì)胞膜上,NNT、MTCH2蛋白分布在線粒體,YIPF5、SEC61B、SERP1、ATL2、CYB5A蛋白分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
　　運(yùn)用化學(xué)發(fā)光免疫共沉淀的方法進(jìn)行蛋白相互作用確認(rèn)實(shí)驗(yàn),酵母共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性蛋白與HEVORF2均存在相互作用,即與1型H

5、EVORF2相互作用的豬蛋白9個(gè),與4型HEVORF2相互作用的豬蛋白17個(gè)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫共沉淀法定量比較酵母共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性豬蛋白與基因1型、4型HEVORF2相互作用強(qiáng)度差異,YIPF5蛋白和SEC61B蛋白與4型HEVORF2的相互作用結(jié)合強(qiáng)度大于基因1型HEVORF2,并且這種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這兩個(gè)蛋白與HEV的宿主差異性是否有關(guān),值得進(jìn)一步研究。
　　這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究HEV感染復(fù)制和宿主限制性的機(jī)制提供了線索和方向