戊型肝炎病毒在家禽、家畜中的流行及其ORF3蛋白與人肝細(xì)胞蛋白相互作用的研究.pdf

1、戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)是戊型肝炎的病原體,是一種重要的傳染因子。逐漸積累起來的研究結(jié)果顯示戊型肝炎是一種人獸共患病,自然界存在HEV的動(dòng)物宿主。我國(guó)是戊型肝炎的流行區(qū),既有爆發(fā)流行也有散發(fā)病例,近年來散發(fā)病例報(bào)告數(shù)持續(xù)增加,可能與動(dòng)物源性HEV的傳播有關(guān)。了解HEV在我國(guó)動(dòng)物中的流行情況,對(duì)于預(yù)防和控制戊型肝炎的流行、減少發(fā)病具有重要意義。在本研究中,我們從不同省份采集我國(guó)主要飼養(yǎng)動(dòng)物的血清,對(duì)HEV

2、在各種動(dòng)物中的感染率、感染水平進(jìn)行了調(diào)查分析,并對(duì)HEV基因型、基因亞型的分布進(jìn)行了分析研究。為了進(jìn)一步探索HEV感染、致病以及不同基因型別HEV宿主差異的分子機(jī)制,我們應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)人肝cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選,篩選了與HEV ORF3蛋白有相互作用的蛋白分子,并對(duì)不同基因型HEV ORF3蛋白與肝細(xì)胞蛋白的相互作用進(jìn)行比較;通過對(duì)這些蛋白分子的生物學(xué)信息分析,對(duì)ORF3蛋白的功能及其對(duì)宿主細(xì)胞生物過程可能產(chǎn)生的影響進(jìn)行了分析、推測(cè)

3、。
　　 1.HEV在我國(guó)家畜、家禽中流行情況的調(diào)查
　　 從我國(guó)的27個(gè)省(市)共采集了豬、牛、羊、家兔、雞和鴨血清6329份,應(yīng)用EIA方法測(cè)定血清中HEV抗體和抗原。結(jié)果顯示,豬、牛、羊和家兔的平均HEV抗體陽(yáng)性率分別為82.2％、28.2％、10.4％和15.4％,豬HEV抗體陽(yáng)性率明顯高于牛、羊和家兔。雞和鴨的抗體陽(yáng)性率分別為3.58％和7.1％,二者都明顯低于豬、牛、羊和家兔。來源于不同省份的動(dòng)物HEV抗體的

4、陽(yáng)性率有明顯差異,豬、牛、羊和家兔HEV抗體陽(yáng)性率范圍分別為10.9％～100％、0～92.9％、0～48％和0～53.4％。大約1.9％的豬、0.8％的牛、1.6％的羊以及3.8％的兔血清樣本為HEV抗原陽(yáng)性。雞和鴨的抗原陽(yáng)性率分別為1.79％和1.43％。
　　 應(yīng)用Nested RT-PCR在15份豬血清和22份不同品種的家兔的血清中檢測(cè)到了HEV RNA,而牛、羊、雞和鴨血清中未檢測(cè)到HEV RNA。通過對(duì)ORF2區(qū)域3

5、04bp長(zhǎng)的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化樹分析,15株豬HEV均屬于基因4型。在進(jìn)化樹上,這15株4型HEV被分在不同的四組,分別為4a、4d及兩個(gè)新的亞型。綜合分析表明,我國(guó)豬群中流行的HEV主要為基因4型HEV,包括4a,4b,4d,4f,4g以及本研究新發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)亞型。從家兔中分離到的22株HEV均屬于兔HEV,在進(jìn)化樹上,兔HEV又進(jìn)一步分成了3組,很可能代表三個(gè)基因亞型。
　　 本研究表明HEV在我國(guó)家畜、家禽中普遍流行,

6、豬HEV感染率最高,我國(guó)流行的豬HEV主要為基因4型,包括4a,4b,4d,4f,4g以及兩個(gè)新亞型。證實(shí)了兔HEV在我國(guó)不同地區(qū)不同品種的家兔中均有流行,支持兔HEV屬于一個(gè)新基因型的觀點(diǎn)。牛、羊、雞和鴨血清樣本中都檢測(cè)到了HEV抗原,但未能檢測(cè)出HEVRNA,仍需進(jìn)一步研究。
　　 2.HEV ORF3蛋白與肝細(xì)胞蛋白相互作用的研究
　　 本研究以基因1型和4型HEV ORF3蛋白為誘餌,通過酵母配對(duì)雜交實(shí)驗(yàn)對(duì)人肝c

7、DNA文庫(kù)進(jìn)行篩選,篩選結(jié)果應(yīng)用酵母雜交共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。經(jīng)過三次實(shí)驗(yàn),篩選出了32種與ORF3蛋白有相互作用的肝細(xì)胞蛋白。其中4種蛋白(4/32,12.5％)已經(jīng)有報(bào)告能夠與ORF3蛋白結(jié)合。進(jìn)一步應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)化學(xué)發(fā)光免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)對(duì)酵母雜交實(shí)驗(yàn)的篩選結(jié)果的可靠性進(jìn)行評(píng)估,顯示篩選結(jié)果的可信度比較高。
　　 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這32種相互作用蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)、以及線粒體、內(nèi)涵體膜中均有分布,大多

8、數(shù)蛋白定位于細(xì)胞的多個(gè)部位。這些蛋白分別參與細(xì)胞代謝、細(xì)胞免疫、細(xì)胞黏附等多個(gè)生物學(xué)過程。因此推測(cè)ORF3蛋白可能通過與這些蛋白相互作用,發(fā)揮多重作用。通過對(duì)蛋白功能富集聚類分析,發(fā)現(xiàn)分別有顯著多數(shù)量的相互作用蛋白參與血液凝固、氧化應(yīng)激和鐵代謝過程。結(jié)合戊型肝炎臨床表現(xiàn)和肝組織的病理特征進(jìn)行分析,推測(cè)ORF3可能通過與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用,影響凝血、脂質(zhì)代謝以及鐵代謝,而引發(fā)相應(yīng)的病理過程。
　　 通過酵母雜交共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分別檢

9、測(cè)基因1型HEV、4型HEV、兔HEV以及禽HEV ORF3蛋白與以基因4型和1型HEV ORF3為誘餌篩選到的這32種人肝細(xì)胞蛋白是否有相互作用。結(jié)果顯示,基因1型、4型和兔HEV的ORF3蛋白都能夠與這些蛋白結(jié)合,然而禽HEV的ORF3蛋白只與其中的13種蛋白有相互作用。因此,禽HEV對(duì)人肝細(xì)胞的影響作用可能不同于哺乳動(dòng)物HEV,這種蛋白相互作用的差別是否與禽HEV與哺乳動(dòng)物HEV宿主范圍等的差別有關(guān)聯(lián),還需要進(jìn)一步研究。