人巨細(xì)胞病毒miR-UL70-1-5p靶基因的篩選與鑒定.pdf

1、目的：
　　 人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染在人群中普遍存在，是引起新生兒疾病和先天畸形的重要感染因素之一，但HCMV先天感染的致病機(jī)制尚不清楚。自2005年開始，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HCMV表達(dá)了至少14種miRNA，miR-UL70-1-5p是其中之一，這些miRNA在病毒感染過程中的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用。目前，對miR-UL70-1-5p在HCMV感染過程中生物學(xué)功能的研究少有文

2、獻(xiàn)報道，而且最近有學(xué)者對其表達(dá)與否存在質(zhì)疑。本研究擬采用實時熒光定量PCR，hybridPCR，熒光素酶報告基因表達(dá)檢測實驗和免疫印跡實驗(western blot)等方法研究miR-UL70-1-5p的表達(dá)情況及其對相關(guān)靶基因的調(diào)控作用。
　　 材料和方法
　　 一、實驗材料
　　 標(biāo)本為中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病毒研究室保存的臨床低傳代分離株Han株；所用試劑為涉及反轉(zhuǎn)錄、RNA提取、PCR擴(kuò)增、基因重組、熒

3、光素酶報告基因檢測、免疫印跡等實驗的相關(guān)試劑盒；常用實驗設(shè)備包括Beckman臺式低溫高速離心機(jī)、Bio-radPCR循環(huán)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱和熒光檢測設(shè)備等；常用數(shù)據(jù)庫及分析軟件包括基因組數(shù)據(jù)庫、凝膠成像及掃描分析軟件、引物設(shè)計軟件等。
　　 二、實驗方法
　　 1、采用實時熒光定量PCR的方法檢測HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞中miR-UL70-1-5p的表達(dá)，并回收擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序。
　　 2、通過hybrid

4、PCR的方法篩選靶基因。
　　 3、將獲得的靶基因的miRNA結(jié)合區(qū)及其附近500bp左右的序列構(gòu)建到熒光表達(dá)載體pMIR中，通過熒光素酶報告基因表達(dá)檢測熒光值的變化，確定miR-UL70-1-5p與靶基因的結(jié)合作用。
　　 4、通過western blot的方法檢測miR-UL70-1-5p對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。
　　 結(jié)果：
　　 1、通過Taqman實時熒光定量PCR檢測及后續(xù)PCR產(chǎn)物克隆測序

5、鑒定等系列實驗，觀察到miR-UL70-1-5p在HCMV感染的成纖維細(xì)胞中存在表達(dá)，其表達(dá)量隨病毒培養(yǎng)時間的延長而增加，感染后72小時最高。
　　 2、經(jīng)過hybridPCR篩選，共得到10個候選靶基因，涉及到生物大分子合成、細(xì)胞間連接、細(xì)胞凋亡、能量代謝、病毒復(fù)制等方面。候選靶基因有8個來源于宿主，2個來源于病毒基因組。
　　 3、熒光素酶報告基因表達(dá)檢測結(jié)果顯示7個候選靶基因明顯受到miR-UL70-1-5p的負(fù)調(diào)

6、控，分別是：NAD(P)H脫氫酶(NQO2)；DNA64903；COX4鄰域蛋白(COX4NB)；即刻早期反應(yīng)蛋白3(IER3)；酪氨酸3-單加氧酶/色氨酸5-力口單氧酶激活蛋白，β-多肽(YWHAB)；鈣粘蛋白相關(guān)蛋白；α1(CTNNA1)和HCMVUL70。
　　 4、對靶基因IER3進(jìn)行了蛋白表達(dá)水平的檢測，結(jié)果表明在表達(dá)IER3的重組質(zhì)粒PBI-IER3與miR-UL70-1-5p共轉(zhuǎn)染的情況下，IER3蛋白的表達(dá)水平被