人巨細胞病毒miRNA-US4-1及miRNA-US4-5p靶基因的篩選和功能研究.pdf

1、目的:
　　人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在人群中呈普遍感染狀態(tài)，一般為隱性感染，多數感染者為健康的病毒攜帶者。但在先天感染及免疫能力低下的人群中，HCMV的致病率和死亡率顯著提高，其詳細致病機理尚不清楚。HCMV是目前唯一被證實具有編碼miRNA能力的β皰疹病毒，研究表明，miRNA對細胞凋亡、增殖、分化、致癌等生物過程有調節(jié)作用。近年來，HCMV編碼miRNA對基因轉錄后調控的研究也成為H

2、CMV致病機理研究的熱點。
　　迄今為止已經發(fā)現HCMV從16種前體中至少編碼26種成熟的miRNAs，自從2004年第一次報道病毒表達miRNAs后;大量的研究表明，病毒的miRNAs發(fā)揮著豐富的作用，這其中包括:增殖，分化，細胞周期，凋亡和免疫應答。
　　凋亡是程序性的細胞死亡，通常具有明顯的形態(tài)特征，包括細胞皺縮，卷曲，固縮以及能量依賴的生化機制。HCMV編碼的miRNAs被報道有調控細胞凋亡的能力。例如miR-UL1

3、48D可以通過下調IEX-1的表達發(fā)揮抗凋亡的作用，miR-US25-1可以通過靶向BRCA1/BRCA2復合體亞族3，增加氧化低密度脂蛋白介導的凋亡。然而miR-US4-1和miR-US4-5p在細胞凋亡中的作用還沒有被報道過。
　　為明確miR-US4-1和miR-US4-5p的生物學功能，本研究擬采用hybrid PCR、熒光素酶活性檢測實驗及免疫印跡實驗(Western blot)等方法來鑒定與miR-US4-1和miR-

4、US4-5p相互作用的靶基因。并針對不同靶基因的生物學功能設計不同的功能研究實驗路線，明確miR-US4-1和miR-US4-5p的生物學功能。
　　方法:
　　一、實驗材料
　　1、HCMV臨床分離株Han、HCMV han株細菌人工染色體(HCMV han BAC)
　　2、人胚腎細胞HEK293、人胚肺成纖維細胞HELF、人外周血的單核細胞系THP-1。
　　3、核酸提取相關試劑
　　4、熒光定

5、量PCR檢測相關試劑
　　5、構建表達載體相關試劑
　　6、雙螢光素酶試驗檢測相關試劑
　　7、Western blot印跡雜交的相關試劑
　　8、Power SYBR Green PCR檢測試劑
　　9、凋亡檢測試劑
　　10、常用實驗設備包括紫外分光光度計、流式細胞儀、熒光分光光度計、酶標儀、全溫振蕩培養(yǎng)箱、自動凝膠成像分析儀等。
　　11、常用分析軟件及數據庫包括凝膠成像及掃描分析軟件、基

6、因組數據庫、SPSS version13.0、引物設計軟件(Primer5)等。
　　二、實驗方法
　　人巨細胞病毒miR-US4-1靶基因的鑒定及功能研究
　　1、采用實時熒光定量PCR方法檢測HCMV感染人胚肺成纖維細胞中miR-US4-1的表達。
　　2、采用hybrid PCR方法篩選HCMV感染人胚肺成纖維細胞中miR-US4-1靶基因。
　　3、將hybrid PCR方法獲得的靶基因以及生物信息

7、學軟件預測的靶基因的3'-UTR全長序列構建到pMIR-REPORTERTM Luciferase載體中，通過熒光素酶活性檢測熒光值的變化判斷miR-US4-1與候選靶基因3'-UTR的結合能力，并確定與細胞凋亡相關的谷氨酰胺tRNA合成酶(QARS)。
　　4、構建QARS3'-UTR突變型熒光素酶報告基因表達載體，應用熒光素酶活性檢測，進一步驗證miR-US4-1與QARS3'-UTR的直接結合作用。
　　5、通過Wes

8、tern blot方法檢測miR-US4-1對HCMV感染刺激下HELF細胞產生的內源性QARS蛋白表達水平的影響。
　　6、利用流式細胞術檢測體外過表達miR-US4-1靶向調控QARS表達對HCMV感染狀態(tài)下的細胞凋亡的影響。
　　7、繪制過表達miR-US4-1的HCMV病毒生長曲線，明確miR-US4-1與感染性病毒顆粒釋放的關系。
　　人巨細胞病毒miR-US4-Sp靶基因的鑒定及功能研究
　　1、采用

9、實時熒光定量PCR方法檢測HCMV感染人胚肺成纖維細胞中miR-US4-5p的表達。
　　2、采用hybrid PCR和軟件篩選方法篩選HCMV感染人胚肺成纖維細胞中miR-US4-5p靶基因。
　　3、將兩種篩選方法的共同候選靶基因P21活化蛋白激酶2(PAK2)的3'-UTR全長序列構建到pMIR-REPORTERTM Luciferase載體中，通過熒光素酶活性檢測熒光值的變化判斷miR-US4-5p與候選靶基因P21

10、活化蛋白激酶2(PAK2)3'-UTR的結合能力。
　　4、構建PAK23'-UTR突變型熒光素酶報告基因表達載體，應用熒光素酶活性檢測，進一步驗證miR-US4-5p對PAK23'-UTR的直接結合作用。
　　5、通過Western blot方法檢測miR-US4-5p對HEK-293、HELF及THP-1等三種不同細胞系內源性表達的PAK2蛋白質水平的影響;以及在HCMV感染的HELF細胞中，不同時相PAK2蛋白表達水平

11、的差異。
　　6、利用流式細胞術檢測過表達miR-US4-5p對細胞凋亡的影響。
　　結果:
　　一、人巨細胞病毒miR-US4-1靶基因的鑒定及功能研究
　　1、通過Taqman實時熒光定量PCR檢測，觀察到miR-US4-1的表達量在感染HCMV時高表達
　　2、經過hybrid PCR篩選，共得到8個候選靶基因。其中與細胞凋亡相關的靶基因QARS3'-UTR與miR-US4-1結合能力較強，而miR-

12、US4-1針對QARS3'-UTR突變型的負調控能力消失。
　　3、對靶基因QARS進行了蛋白表達水平的檢測，結果表明QARS蛋白的表達水平被miR-US4-1下調，證實QARS是miR-US4-1的直接靶基因。
　　4、檢測HCMV感染不同時相，HELF中QARS蛋白和miR-US4-1的表達，發(fā)現二者負相關。
　　5、檢測過表達miR-US4-1對于感染HCMV的人胚肺成纖維細胞HELF凋亡的影響。發(fā)現miR-US

13、4-1可以增加HCMV感染所導致的凋亡。
　　6、進一步繪制了HCMV生長曲線，結果表明過表達miR-US4-1可以促進感染性病毒顆粒的釋放。
　　二、人巨細胞病毒miR-US4-5p靶基因的鑒定及功能研究
　　1、熒光素酶活性檢測結果顯示候選靶基因P21活化蛋白激酶2(PAK2)明顯受到miR-US4-5p的負調控。而種子區(qū)突變后，miR-US4-5p針對PAK23'-UTR突變型的負調控能力消失。
　　2、對

14、靶基因PAK2進行了蛋白表達水平的檢測，結果顯示HEK-293、HELF及THP-1三種不同細胞系表達的PAK2水平均被miR-US4-5p明顯下調，證實PAK2是miR-US4-5p的直接靶基因。
　　3、HCMV感染下調PAK2蛋白水平，其中感染72 h下調最明顯。
　　4、流式細胞術檢測發(fā)現過表達miR-US4-5p靶向下調PAK2表達促進饑餓誘導的三種不同細胞的凋亡。
　　結論:
　　1、人巨細胞病毒mi