肝細(xì)胞肝癌相關(guān)基因中miRNA結(jié)合靶點(diǎn)內(nèi)多態(tài)的篩選及功能分析.pdf

1、目的：篩選肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)相關(guān)基因中miRNA結(jié)合靶點(diǎn)內(nèi)的基因多態(tài)并驗(yàn)證其與HCC發(fā)生的關(guān)聯(lián)性進(jìn)而探討其中的具體分子機(jī)制。
　　 方法：⑴利用生物信息學(xué)方法結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道篩選HCC相關(guān)基因，并在HCC相關(guān)基因3′UTRs或5′UTRs中預(yù)測(cè)目前人類(lèi)已知miRNA的結(jié)合靶點(diǎn)，然后在預(yù)測(cè)靶點(diǎn)內(nèi)篩出候選多態(tài)。⑵基于第一步預(yù)測(cè)結(jié)果，采用病例對(duì)照研究方法，PCR擴(kuò)增結(jié)合聚丙烯胺凝膠電泳技

2、術(shù)對(duì)部分候選多態(tài)進(jìn)行基因分型，Logistic統(tǒng)計(jì)分析基因位點(diǎn)與HCC的關(guān)聯(lián)性。⑶對(duì)發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性關(guān)聯(lián)基因多態(tài)位點(diǎn)，利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)該位點(diǎn)可能結(jié)合的miRNA；采用定點(diǎn)突變和分子克隆技術(shù)，構(gòu)建不同基因型熒光素酶表達(dá)載體，與特定miRNA共轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系(HepG2和SMCC7721)，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)熒光素酶表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。(4)采用Real-time RT-PCR方法，分析陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)不同基因型的肝癌組織樣本目的基因的表

3、達(dá)水平。
　　 結(jié)果：①利用生物信息學(xué)方法結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道篩選出HCC相關(guān)基因105個(gè)，并在HCC相關(guān)基因3′UTRs或5′UTRs中已知miRNA結(jié)合靶點(diǎn)內(nèi)篩出16個(gè)候選多態(tài)(含SNPs和插入缺失多態(tài))。②我們從16個(gè)候選多態(tài)中選取了兩個(gè)插入缺失多態(tài)進(jìn)行病例對(duì)照研究，分別是位于IL1A-3′UTR的rs3783553(“TTCA” 4bp插入缺失)和位于VEGF-5′UTR的rs35569394(“TCCCACTCTTCCCACA

4、GG”18bp插入缺失)?；蚍中徒Y(jié)果顯示，rs3783553和rs35569394均具有較好多態(tài)性，其在對(duì)照樣本中最低等位基因頻率分別為0.385和0.255。兩位點(diǎn)在對(duì)照樣本中的等位基因頻率分布均符合Hardy-weinberg平衡?？ǚ綑z驗(yàn)顯示rs3783553的基因型和等位基因頻率在HCC組和對(duì)照組均存在顯著性差異。用Logistic回歸分析校正年齡、性別、吸煙、飲酒及HBV感染因素后發(fā)現(xiàn)，與4N Ins/4N Del和4N D

5、el/4N Del相比，攜帶有4N Ins/4N Ins的個(gè)體HCC易感性明顯降低(OR=0.30，95[％]CI：0.17-0.54)，趨勢(shì)檢驗(yàn)P值<0.001?？紤]到HBV感染與HCC發(fā)生的密切關(guān)系，我們對(duì)HBV進(jìn)行了分層分析，結(jié)果顯示，分層后插入型等位基因的保護(hù)作用仍能體現(xiàn)，但在HBV陽(yáng)性的患者中更為突出。該結(jié)果提示，rs3783553多態(tài)可能在HBV感染的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮作用。而rs35569394經(jīng)上述分析后發(fā)現(xiàn)與HCC易感

6、性不存在顯著性關(guān)聯(lián)，趨勢(shì)檢驗(yàn)P值=0.87。③根據(jù)rs3783553病例對(duì)照研究結(jié)果，我們分別構(gòu)建了rs3783553兩種不同基因型熒光素酶載體，基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，將Pre-mir-122或Pre-mir-378與重組載體共轉(zhuǎn)染HepG2和SMCC7721兩種肝癌細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在加入不同濃度的Pre-mir-122后，與含有“TTCA”插入型等位基因的載體比較，含有“TTCA”缺失型等位基因載體的熒光強(qiáng)度顯著下降，并呈現(xiàn)梯

7、度依賴(lài)趨勢(shì)。就miR-378而言，當(dāng)Pre-mir-378濃度加大到10pmol以上時(shí)，我們觀察到了同樣的變化趨勢(shì)，但rs3783553對(duì)miR-378與靶序列的結(jié)合的影響較miR-122小。④Taqman熒光定量PCR方法對(duì)不同rs3783553基因型肝癌組織樣本的IL-1α mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，4N Ins/4N Ins純合子組的樣本IL-1α mRNA表達(dá)水平最高，依次高于雜合子組和4N Del/4N Del純合子組。

8、26個(gè)4N Del/4N Del純合子樣本中有3個(gè)IL-1α mRNA表達(dá)水平未達(dá)到檢測(cè)閾值，Ct按最大循環(huán)數(shù)40計(jì)算。非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)顯示三組間IL-1α mRNA表達(dá)水平存在顯著性差異(P=0.042)，其中4N Ins/4N Ins組和雜合子組IL-1α mRNA的表達(dá)水平分別是4N Del/4N Del組的5.57和3.76倍。
　　 結(jié)論：⑴病例對(duì)照研究數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，位于IL1A-3′UTR的

9、rs3783553與HCC易感性存在顯著性關(guān)聯(lián)，HBV分層后分析結(jié)果提示rs3783553多態(tài)可能在HBV感染的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮作用，值得進(jìn)一步深入研究；位于VEGF-5′UTR的rs35569394與HCC易感性未發(fā)現(xiàn)顯著性關(guān)聯(lián)；⑵根據(jù)體外及體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果，我們初步闡明了rs3783553參與HCC發(fā)生的具體分子機(jī)制，即rs3783553位點(diǎn)“TTCA” 四堿基插入破壞了miR-122與IL1A-3′UTR的緊密結(jié)合，使得miR-12