HBV相關(guān)肝細(xì)胞肝癌組織中HBV cccDNA突變位點的篩選及功能研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（ hepatitis B virus， HBV）突變與肝細(xì)胞肝癌（ hepatocellular carcinoma，HCC）的相關(guān)性一直是乙肝病毒致癌作用研究的熱點。然而，從感染 HBV到 HCC，往往經(jīng)歷“慢乙肝-肝硬化-HCC”這一漫長過程，加之 HBV基因組易于變異和宿主的免疫選擇壓力，感染者體內(nèi)的 HBV往往存在與“野生序列”高度相關(guān)但不完全相同的變異株的動態(tài)種群，即準(zhǔn)種。這一現(xiàn)象提示我們，每一個體內(nèi) HBV的突

2、變往往隨著感染時間和疾病進程而逐漸增加。在既往研究中，通過比較 HBV感染不同時期的患者外周血中病毒的突變情況，發(fā)現(xiàn)了與 HCC相關(guān)的 HBV突變。但由于肝癌患者血清中的HBV突變來自于肝癌組織和非癌肝組織中的 cccDNA突變，并且癌組織中病毒復(fù)制能力相對較弱。因此，血清中病毒 DNA的突變不能有效地反映肝癌組織中HBV cccDNA的突變情況。HBV共價閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，

3、cccDNA）只存在于感染的肝細(xì)胞核中，是 HBV復(fù)制的模板，具有一定的組織特異性。同時，為消除不同感染階段這一時間因素對 HBV變異程度的影響，本實驗通過比較 HCC患者配對的肝癌與癌旁組織中 HBV cccDNA突變位點的差異，分析這些病毒突變的臨床相關(guān)性，尋找與 HCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的病毒突變位點，開展與 HCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的病毒突變位點相應(yīng)的功能研究，探索 HBV基因組突變的可能致癌機制。
　　本研究采用29例 HCC患

4、者術(shù)后的癌與癌旁組織，通過實時熒光定量 PCR檢測組織中 HBV cccDNA和 HBV total DNA水平，滾環(huán)擴增及 PCR產(chǎn)物直接測序 HBV cccDNA全基因組，與野生序列比對尋找 HBV cccDNA的突變位點，并分析 HBV cccDNA突變位點的臨床相關(guān)性。以 HBV1.2×質(zhì)粒為基礎(chǔ)，通過定點突變技術(shù)，構(gòu)建HBV1.2×-G588C突變及HBV1.2×-T1719G突變質(zhì)粒，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測病毒突變位

5、點對細(xì)胞內(nèi)3.5kb RNA和total RNA及上清中HBV DNA水平的影響，用時間分辨熒光法檢測病毒突變位點對細(xì)胞培養(yǎng)上清中 HBsAg和 HBeAg含量的影響。采用雙熒光素酶報告實驗檢測 T1719G突變后是否對 HBV EnhII的活性有影響，并進一步通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP）-PCR技術(shù)檢測 T1719G突變后對 HNF3β與 EnhII之間結(jié)

6、合力的影響。通過分別與野生型 HBx質(zhì)粒及HBx-T1719G突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，檢測T1719G突變的HBx蛋白對HBV復(fù)制能力的影響。研究結(jié)果如下：
　?。?）完成了25個癌組織標(biāo)本和29個癌旁組織標(biāo)本中 HBV cccDNA的全基因組測序，其中有19對是配對的癌組織與癌旁組織。在19對HBV cccDNA序列中，18對是C基因型，1對是B基因型。25個癌組織的HBV cccDNA序列中23個是HBV C基因型。將所得到的18對

7、 C基因型的 cccDNA序列與 HBV的野生序列進行比對，獲得HBV cccDNA全基因組的突變位點。以突變率大于10％的作為突變熱點，共篩選出突變熱點233個。完成了29對癌與癌旁組織HBV cccDNA和total DNA的定量檢測。
　?。?）將23個癌組織中的各突變位點與患者的臨床資料（術(shù)后生存時間，BCLC分級、術(shù)前 AFP濃度等）及 HBV DNA定量結(jié)果進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示 T1719G、C1329A和 T30

8、98C突變與患者的術(shù)后生存時間相關(guān)，攜帶突變型A1329或C3098的肝癌患者術(shù)后生存時間長于攜帶野生型 C1329或T3098的患者，而 G1719突變組肝癌患者的術(shù)后生存時間短于 T1719野生型組；G1078T、C1653T、G1727A、C1913A、T1978C和 C3116T突變位點與患者術(shù)前高濃度的 AFP相關(guān)；T1719G和 C1913A兩個突變位點與HBV DNA定量結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義，其中，突變型G1719組HBV c

9、ccDNA和HBV total DNA含量均低于野生型T1719組，突變型A1913組HBV cccDNA的含量高于野生型 C1913組；我們還發(fā)現(xiàn)，突變位點 T1719G與患者的 BCLC分級相關(guān)， T1719野生型組傾向于較低的 BCLC分級，G1719突變型組傾向于較高的 BCLC分級結(jié)果提示T1719G突變后患者的預(yù)后差；并且Cox多因素分析結(jié)果顯示T1719G突變是HCC患者術(shù)后生存時間的獨立的危險預(yù)后預(yù)測因素，而T3098C

10、突變是HCC患者術(shù)后生存時間的獨立的保護預(yù)后因素。
　?。?）G588C突變（可引起 G145A氨基酸突變）只存在于3例癌組織（7C、569C、831C）中，提示 G588C突變可能與 HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。G588C突變型組上清中HBsAg的含量低于野生型組（p〈0.05），G588C突變型組細(xì)胞內(nèi)的 HBsAg的含量高于野生型組（p〈0.05），G588C突變型組HBsAg的總量和HBV1.2×野生型組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

11、p〉0.05），而 G588C突變型組上清中 HBsAg與細(xì)胞內(nèi) HBsAg的比值明顯低于HBV1.2×野生型組（p〈0.05），并且，G588C突變型組上清中HBV DNA水平與HBV1.2×野生型組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p〉0.05）。結(jié)果表明G588C突變不影響HBV的復(fù)制能力，也不影響HBsAg的表達(dá)，而可能影響了HBsAg從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外的分泌。
　?。?）在 Huh7和 HepG2肝癌細(xì)胞中，HBV1.2×-T171

12、9G突變型質(zhì)粒與 HBV1.2×野生型質(zhì)粒相比，可以明顯降低培養(yǎng)上清中 HBsAg和 HBeAg的含量（p〈0.001）、細(xì)胞內(nèi) HBV total RNA和3.5kb RNA水平（p〈0.001）、細(xì)胞培養(yǎng)上清中 HBV DNA水平（p〈0.001），雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)，在 Huh7、HepG2、SK-Hep1和 HEK293T四種肝癌細(xì)胞中，T1719G突變組的 EnhII的活性低于野生型組（p〈0.001），當(dāng)野生型質(zhì)粒和T1

13、719G突變型質(zhì)粒分別與HNF3β質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時，T1719G突變組的EnhII的活性也低于野生型組（ p〈0.001），提示 T1719G突變既降低了 EnhII活性，又影響了HNF3β對EnhII的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。ChIP-PCR實驗結(jié)果表明T1719G突變影響了HNF3β和 HBV EnhII之間的結(jié)合力，突變型 G1719與 HNF3β之間的結(jié)合力弱于 T1719與HNF3β之間的結(jié)合力。在 Huh7和 HepG2細(xì)胞中，當(dāng)

14、HBV1.2×和 HBV1.2×-T1719G質(zhì)粒與 HBx質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染時，與未共轉(zhuǎn)染組相比上清中 HBsAg和 HBeAg的水平?jīng)]有明顯變化（p〉0.05）；但當(dāng)HBV1.2×和HBV1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染時，與未共轉(zhuǎn)染組相比，上清中 HBsAg和 HBeAg的水平仍然明顯下降（ p〈0.001）；并且， HBV1.2×-T1719G質(zhì)粒與 HBx-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組上清中的HBsAg和HBeAg的水平

15、低于HBV1.2×質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組（p〈0.001）；而HBV1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組上清中的HBsAg和HBeAg的水平與HBV1.2×質(zhì)粒與 HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p〉0.05）；當(dāng) HBV1.2×和HBV1.2×-T1719G質(zhì)粒與HBx質(zhì)?；騂Bx-mut突變質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染時，與未共轉(zhuǎn)染組相比上清中HBV DNA的水平都升高（p〈0.001）；但HBV1.2×-T1719G

16、質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組上清中HBV DNA的水平低于HBV1.2×質(zhì)粒與HBx-mut質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p〈0.001）；而 HBV1.2×-T1719G質(zhì)粒與 HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組上清中HBV DNA的水平與HBV1.2×質(zhì)粒與HBx質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p〉0.05）。這些結(jié)果表明T1719G突變可以降低HBV的復(fù)制能力，其中突變的HBV EnhII和突變的HBx蛋白都起到了重要的作用。