人巨細(xì)胞病毒miRNA-US33-5p及miRNA-UL36-5p靶基因的篩選和功能研究.pdf

1、目的：
　　人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染在人群中普遍存在，一般呈隱性感染狀態(tài)，多數(shù)感染者為健康的病毒攜帶者。但HCMV先天感染及免疫能力低下的人群感染，其發(fā)病率和死亡率則顯著提高(1)，且致病機(jī)理尚不清楚。HCMV是目前唯一被證實(shí)具有編碼miRNA能力的β皰疹病毒，研究表明，miRNA對(duì)細(xì)胞分化、增殖、凋亡、致癌等生物過(guò)程有調(diào)節(jié)作用(2-6)。近年來(lái)，HCMV編碼miRNA對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)

2、控的研究也成為HCMV致病機(jī)理研究的熱點(diǎn)。
　　迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HCMV至少編碼26種成熟的miRNAs(7)，這些miRNAs在HCMV感染過(guò)程中作用于mRNA使其蛋白質(zhì)翻譯終止甚至降解。例如miRNA-UL112-1通過(guò)下調(diào)HCMV IE72(UL123，IE1)，UL112/113，UL120/121以及UL144的表達(dá)進(jìn)而影響病毒的復(fù)制能力(8-9);同時(shí)miRNA-UL112-1還可通過(guò)與人組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(lèi)相關(guān)基因B

3、(major histocompatibility complex classⅠ-related chain B，MICB)相互作用，從而逃避NK細(xì)胞的識(shí)別(10)。由此可見(jiàn)，HCMV利用自身編碼的miRNAs調(diào)節(jié)自身及宿主細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)而完成病毒復(fù)制、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及免疫逃避等過(guò)程。
　　miR-US33-5p和miR-UL36-5p是HCMV編碼的miRNAs中較早發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)miRNAs。有研究指出miR-US33可減少潛伏狀

4、態(tài)下HCMV DNA復(fù)制(11)，然而，其機(jī)制尚未明確。也有文獻(xiàn)報(bào)道使用hybrid PCR方法篩選出solute carrierfamily25，member6(SLC25A6，又名腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶adenine nucleotidetranslocator3，ANT3)為miR-UL36-5p候選靶基因(12)。為進(jìn)一步明確miR-US33-5p及miR-UL36-5p的生物學(xué)功能，本研究擬采用hybrid PCR(13)、熒光素

5、酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)及免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot)等方法來(lái)鑒定與miR-US33-5p和miR-UL36-5p相互作用的靶基因。并針對(duì)不同靶基因的生物學(xué)功能設(shè)計(jì)不同的功能研究實(shí)驗(yàn)路線，明確miR-US33-5p和miR-UL36-5p在HCMV感染過(guò)程中的生物學(xué)功能。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　1、HCMV臨床分離株Han、HCMV han株細(xì)菌人工染色體(HCMV han BAC)
　　2、人胚腎

6、細(xì)胞HEK293、人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5和HELF、人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373
　　3、核酸提取相關(guān)試劑
　　4、熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)試劑
　　5、構(gòu)建表達(dá)載體相關(guān)試劑
　　6、雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)相關(guān)試劑
　　7、Western blot印跡雜交相關(guān)試劑
　　8、Power SYBR Green PCR檢測(cè)相關(guān)試劑
　　9、凋亡檢測(cè)相關(guān)試劑
　　10、常用實(shí)驗(yàn)設(shè)備包括熒光分光光度

7、計(jì)、紫外分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、自動(dòng)凝膠成像分析儀、全溫振蕩培養(yǎng)箱等。
　　11、常用數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件包括基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、凝膠成像及掃描分析軟件、引物設(shè)計(jì)軟件(Primer5)、SPSS version13.0等。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　人巨細(xì)胞病毒miR-US33-5p靶基因的鑒定及功能研究
　　1、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞中miR-US33-5p的表達(dá)。
　　2、

8、采用hybrid PCR方法篩選HCMV感染人胚肺成纖維細(xì)胞中miR-US33-5p靶基因。
　　3、將hybrid PCR方法獲得的靶基因以及生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)的靶基因的miR-US33-5p結(jié)合區(qū)及其附近400bp左右的序列構(gòu)建到pMIR-REPORTERTMLuciferase載體中，通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)熒光值的變化判斷miR-US33-5p與候選靶基因3'-UTR的結(jié)合能力，并確定與病毒復(fù)制相關(guān)的靶基因突觸融合蛋白synt

9、axin3(STX3)。
　　4、構(gòu)建STX33'-UTR突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，應(yīng)用熒光素酶活性檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-US33-5p與STX33'-UTR的直接結(jié)合作用。
　　5、通過(guò)western blot方法檢測(cè)miR-US33-5p對(duì)HCMV感染刺激下MRC-5細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性STX3蛋白表達(dá)水平的影響。
　　6、利用定量PCR(qPCR)方法檢測(cè)體外過(guò)表達(dá)miR-US33-5p靶向調(diào)控STX3表達(dá)對(duì)

10、HCMV DNA拷貝數(shù)的影響。
　　7、繪制過(guò)表達(dá)miR-US33-5p的HCMV病毒生長(zhǎng)曲線，明確miR-US33-5p與病毒復(fù)制的關(guān)系。
　　人巨細(xì)胞病毒miR-UL36-5p靶基因的鑒定及功能研究
　　1、將已知的miR-UL36-5p候選靶基因腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶ANT3與miR-UL36-5p的結(jié)合區(qū)及其附近267bp的序列構(gòu)建到pMIR-REPORTERTMLuciferase載體中，通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)熒光

11、值的變化判斷miR-UL36-5p與候選靶基因腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶ANT33'-UTR的結(jié)合能力。
　　2、構(gòu)建ANT33'-UTR突變型熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，應(yīng)用熒光素酶活性檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-UL36-5p對(duì)ANT33'-UTR的直接結(jié)合作用。
　　3、通過(guò)western blot方法檢測(cè)miR-UL36-5p對(duì)HEK-293、HELF及U373等三種不同細(xì)胞系內(nèi)源性表達(dá)的ANT3蛋白質(zhì)水平的影響;以及在HCMV感

12、染的HELF細(xì)胞中，ANT3蛋白表達(dá)水平的差異。
　　4、利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-UL36-5p對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　一、人巨細(xì)胞病毒miR-US33-5p靶基因的鑒定及功能研究
　　1、通過(guò)Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，觀察到miR-US33-5p的表達(dá)量隨病毒培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。
　　2、經(jīng)過(guò)hybrid PCR篩選，共得到12個(gè)候選靶基因，涉及到免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)

13、合成、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、能量代謝、以及癌癥發(fā)生甚至HCMV病毒復(fù)制等方面。這些候選靶基因中有2個(gè)來(lái)源于病毒基因組，另外10個(gè)均來(lái)源于宿主基因。
　　3、熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，8個(gè)hybrid PCR方法獲得的候選靶基因及2個(gè)預(yù)測(cè)的候選靶基因中，miR-US33-5p對(duì)其中7個(gè)候選靶基因發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中與HCMV病毒復(fù)制相關(guān)的靶基因突觸融合蛋白STX33'-UTR與miR-US33-5p結(jié)合能力較強(qiáng)，而miR-U

14、S33-5p針對(duì)STX33'-UTR突變型的負(fù)調(diào)控能力消失。
　　4、對(duì)靶基因STX3進(jìn)行了蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，結(jié)果表明STX3蛋白的表達(dá)水平被miR-US33-5p下調(diào)，證實(shí)STX3是miR-US33-5p的直接靶基因。
　　5、通過(guò)實(shí)時(shí)定量HCMV編碼UL83基因DNA表達(dá)量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過(guò)表達(dá)miR-US33-5p能抑制HCMV DNA合成。進(jìn)一步繪制了HCMV生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-US33-5p抑制HCMV復(fù)

15、制。
　　二、人巨細(xì)胞病毒miR-UL36-5p靶基因的鑒定及功能研究
　　1、熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示候選靶基因腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶ANT3明顯受到miR-UL36-5p的負(fù)調(diào)控，而miR-UL36-5p針對(duì)ANT33'-UTR突變型的負(fù)調(diào)控能力消失。
　　2、對(duì)靶基因ANT3進(jìn)行了蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)，結(jié)果顯示HEK-293、HELF及U373三種不同細(xì)胞系表達(dá)的ANT3水平均被miR-UL36-5p明顯下調(diào)，證實(shí)AN

16、T3是miR-UL36-5p的直接靶基因。
　　3、HCMV感染下調(diào)ANT3蛋白水平，其中感染24小時(shí)下調(diào)最明顯。
　　4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-UL36-5p靶向下調(diào)ANT3表達(dá)明顯抑制饑餓誘導(dǎo)的三種不同細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：
　　1、人巨細(xì)胞病毒miR-US33-5p靶向作用突觸融合蛋白STX33'-UTR特定區(qū)域，負(fù)性調(diào)控該基因的表達(dá)，進(jìn)一步影響HCMV DNA合成和DNA復(fù)制。
　　2、