人巨細胞病毒miR-US25-1-5p和miR-US5-1靶基因的篩選和功能研究.pdf

1、人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染在人群中普遍存在，是引起新生兒疾病和先天畸形的重要感染因素之一，但HCMV先天感染的致病機制尚不清楚。近年來，越來越多的研究表明一種在基因轉錄后調(diào)控方面發(fā)揮重要作用的小RNA-microRNA(miRNA)在HCMV感染過程中表達并發(fā)揮重要作用，受到了廣泛關注。
　　迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HCMV至少編碼26種miRNA。研究發(fā)現(xiàn)HCMV miRNA可以調(diào)節(jié)HCM

2、V自身或宿主細胞基因的表達抑制病毒復制，從而有利于潛伏狀態(tài)的形成和長期保持。另外，HCMV miRNA還可以通過靶向作用于相應的靶基因建立免疫逃避機制，并參與宿主細胞分泌通路、細胞周期和細胞凋亡等多個過程的調(diào)控。每個miRNA可以靶向作用于多個靶基因，可能通過不同途徑發(fā)揮調(diào)控作用。對HCMV miRNA靶基因的鑒定和功能研究，將有利于在轉錄后調(diào)控層面解釋病毒與宿主之間的相互作用關系，為揭示HCMV感染的致病機制提供有利的科學資料。

3、>　　本研究中我們首先檢測了HCMV miR-US25-1-5p和miR-US5-1在HCMV感染過程中的表達情況，然后篩選兩者可能調(diào)控的靶基因，并進一步應用熒光素酶檢測和westem blot驗證這兩個miRNA對相應靶基因的調(diào)控作用，最后我們通過過表達miRNA或轉染相應的小干擾RNA(small interferenceRNA，siRNA)抑制靶基因的表達，檢測它們的調(diào)控作用對宿主細胞和/或HCMV DNA復制的影響。對于揭示mi

4、R-US25-1-5p和miR-US5-1在HCMV致病過程中的生物學功能具有重要的意義。
　　第一部分 人巨細胞病毒miR-US25-1-5p靶基因的篩選和功能研究
　　目的：
　　篩選并鑒定人巨細胞病毒miR-US25-1-5p調(diào)控的靶基因，進一步研究人巨細胞病毒miR-US25-1-5p對靶基因的調(diào)控在病毒感染中的作用。
　　方法：
　　HCMV病毒株為中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病毒研究室保存的臨床低傳

5、代分離株Han株;采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)方法檢測HCMV感染后不同時間點MRC5細胞中miRNA-US25-1-5p的表達情況;通過hybrid PCR及其衍生出的方法篩選miRNA-US25-1-5p的候選靶基因;選取靶基因中的YWHAE，UBB，HSP90AA1和NPM1作為進一步研究的對象，將含有miRNA-US25-1-5p結合位點的相應靶基因序列克隆到pMIR載體中，構建野生型報告載體，用Site

6、-directedGene Mutagenesis試劑盒構建含有突變位點的突變型報告載體，將這兩種載體分別與miRNA-US25-1-5p模擬物或miRNA陰性對照共同轉染HEK293細胞，檢測熒光素酶活性變化以判斷miRNA-US25-1-5p與候選靶基因的結合能力;利用pBI-CMV2載體構建靶基因表達載體pBI-YWHAE-Myc，pBI-UBB-Myc和pBI-NPM1-Myc，miRNA-US25-1-5p模擬物或miRNA陰

7、性對照單獨或與靶基因表達載體共轉染HEK293細胞，Western blot檢測靶基因蛋白水平的變化，明確miRNA-US25-1-5p對這些靶基因的調(diào)控作用。根據(jù)文獻合成靶基因的干擾序列，退火后插入到pSilencer4.1載體中，構建特異性阻斷靶基因蛋白表達的小干擾表達載體。miRNA對照、miRNA-US25-1-5p模擬物、miRNA-US25-1-5p抑制劑或相應靶基因的小干擾單獨或與相應靶基因表達載體共轉染MRC5細胞，24

8、小時之后感染HCMV病毒，Western blot和實時定量PCR分別檢測靶基因的蛋白水平和病毒拷貝數(shù)的變化，分析miRNA-US25-1-5p調(diào)控靶基因對HCMV DNA復制的影響。
　　結果：
　　1、miRNA-US25-1-5p在HCMV感染的MRC5細胞中存在表達，其表達量隨病毒感染時間的延長而增加;
　　2、經(jīng)過hybrid PCR及其衍生出的方法篩選，共得到34個候選靶基因，所篩選到的靶基因全來源于宿主細

9、胞，熒光素酶活性檢測和western blot證實了miRNA-US25-1-5p對YWHAE，UBB，HSP90AA1和NPM1的靶向調(diào)控作用;
　　3、在HCMV感染過程中過表達miRNA-US25-1-5p或應用特異的小干擾抑制相應靶基因的表達可以抑制HCMV DNA復制。
　　結論：
　　miRNA-US25-1-5p在HCMV感染的MRC5細胞中高度表達，并可以靶向調(diào)控宿主基因YWHAE，UBB，HSP90A

10、A1和NPM1，miRNA-US25-1-5p對這些靶基因的調(diào)控作用可以抑制HCMV DNA復制。
　　第二部分 人巨細胞病毒miR-US5-1靶基因的篩選和功能研究
　　目的：
　　篩選并鑒定人巨細胞病毒miR-US5-1調(diào)控的靶基因，進一步研究人巨細胞病毒miR-US5-1對靶基因的調(diào)控在病毒感染中的作用。
　　方法：
　　HCMV病毒株為中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院病毒研究室保存的臨床低傳代分離株Han株

11、;采用實時熒光定量PCR(real-time PCR)方法檢測HCMV感染后不同時間點U373細胞中miRNA-US5-1的表達情況。通過hybrid PCR篩選miRNA-US5-1的候選靶基因，將含有miRNA-US5-1結合位點的11個候選靶基因序列克隆到pMIR載體中，構建野生型報告載體，檢測熒光素酶活性變化以判斷miRNA-US5-1與相應靶基因的結合能力，選取與miR-US5-1結合能力較強的geminin(GMNN)作為進

12、一步研究的對象，在野生型報告載體pMIR-GMNN的基礎上利用Site-directed Gene Mutagenesis試劑盒構建含有突變位點的突變型報告載體pMIR-GMNN-MUT，將這兩個載體分別與miRNA-US5-1模擬物或miRNA陰性對照共同轉染HEK293細胞，檢測熒光素酶活性變化進一步驗證miRNA-US5-1與GMNN的結合作用。U373細胞分別轉染miRNA陰性對照，miRNA-US5-1模擬物，miRNA-US

13、5-1模擬物和miRNA-US5-1抑制劑或GMNN特異性小干擾，western blot檢測靶基因GMNN蛋白水平的變化，明確miRNA-US5-1對GMNN的調(diào)控作用。之前有文獻報道GMNN在HCMV感染過程中蓄積，為了證實這一觀點，我們利用western blot檢測了正常、HCMV自然感染及轉染miRNA-US5-1模擬物之后再感染HCMV的U373細胞中GMNN的表達情況。U373細胞分別轉染miRNA對照，miRNA-US5

14、-1模擬物，miRNA-US5-1抑制劑或GMNN特異性小干擾，24小時之后感染HCMV病毒，Western印跡雜交和實時定量PCR分別檢測GMNN的蛋白水平和病毒拷貝數(shù)的變化，分析miR-US5-1調(diào)控GMNN對HCMVDNA復制的影響。U373細胞轉染miRNA-US5-1模擬物或GMNN特異的小干擾，應用流式細胞分析及CCK8試劑盒檢測細胞周期及細胞增殖變化，分析miRNA-US5-1下調(diào)GMNN對細胞周期及增殖帶來的影響。

15、>　　結果：
　　1、miRNA-US5-1在HCMV感染的U373細胞中存在表達，其表達量隨病毒感染時間的延長而增加;
　　2、經(jīng)過hybrid PCR篩選，共得到23個候選靶基因，所篩選到的靶基因全來源于宿主基因組，熒光素酶檢測和western blot證實了miRNA-US5-1對GMNN的靶向調(diào)控作用;
　　3、與正常細胞相比HCMV感染之后GMNN的表達量增加了，且隨著感染時間的延長GMNN的表達量逐漸增加，

16、但過表達miRNA-US5-1抑制了GMNN的增加;
　　4、在HCMV感染過程中過表達miRNA-US5-1或應用特異的小干擾抑制GMNN的內(nèi)源性表達可以抑制HCMV DNA復制;
　　5、通過過表達miRNA-US5-1或應用特異的小干擾抑制GMNN的內(nèi)源性表達，可以影響細胞周期分布及細胞增殖，表現(xiàn)為G1期細胞減少、進入S和G2期細胞增加及細胞增殖增加;
　　結論：
　　miRNA-US5-1在HCMV感染的