人巨細(xì)胞病毒UL123基因的克隆、表達(dá)和細(xì)菌雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、目的：在IMPACT-TWIN蛋白純化系統(tǒng)中克隆和表達(dá)人巨細(xì)胞病毒(HCMV)ULl23基因(iel)外顯子4(iel-exon4)及其cDNA全長，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定；在細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)中克隆和表達(dá)HCMViel-exon2，3及iel-exon4，構(gòu)建細(xì)菌雙雜交誘餌質(zhì)粒，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化子自身激活作用鑒定。 方法：①提取感染了HCMV AD<,169>的人胚肺成纖維細(xì)胞(HEL)的DNA和RNA，以DNA和

2、RNA為模板，分別用PCR和RT-PCR擴(kuò)增iel-exon4和iel cDNA全長，再分別克隆入原核表達(dá)載體pTWINl上intein2的N端，轉(zhuǎn)化E.coli ER 2566，經(jīng)PCR、限制性酶切和測序鑒定陽性重組子，在低溫和低IPTG濃度下誘導(dǎo)重組子表達(dá)可溶性重組融合蛋白rIEl-C<,86-491>／intein2和rIEl／intein2，用SDS-PAGE和Western Blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。②以重組質(zhì)粒pTWINl

3、／iel為模板擴(kuò)增iel-exon2，3和iel-exon4，分別克隆入pBT質(zhì)粒上入CI的C端，轉(zhuǎn)化E.coli XLl-Blue MRF’Kan，經(jīng)PCR、限制性酶切和測序鑒定陽性重組子，提取陽性重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化入細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)報告菌株，在30℃和低IPTG濃度下誘導(dǎo)重組子表達(dá)可溶性重組融合蛋白rIEl一N<,85>／λC1和rIEI-C<,86-49l>／λC1，用SDS-PAGE和Western Blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并進(jìn)

4、一步鑒定重組子自身激活作用。 結(jié)果：①成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pTWINl／iel-exon4和pTWINl／iel，并在E.coli ER 2566中分別高效表達(dá)了重組融合蛋白rIEl-C<,86-491>／intein2和rIEl／intein2。②細(xì)菌雙雜交誘餌質(zhì)粒pBT／iel-exon2,3和pBT／iel-exon4構(gòu)建成功，并在報告菌株中分別表達(dá)了重組融合蛋白rIEl-N<,85>／λC1和rIEl-C<,86-491>